时间：2022-05-05 09:07:07
摘要：目的 探讨线粒体呼吸链复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ在海洛因海绵状白质脑病的作用。方法 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定36例急性期海洛因白质脑病患者与36例正常对照者外周血线粒体呼吸链复合物活性的吸光度，并比对标准曲线，计算样品中人线粒体呼吸链复合物浓度。结果 正常对照组和海洛因组线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性测定结果不符合正态分布，经Wilcoxon W检验，两组间有显著差异（Z=-4.015.P<0.001）;线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性测定结果分别为21.75±5.15U/ml和17.42±4.02U/ml，两组间有显著差异（t=3.978，P<0.001）;线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性测定结果分别为145.79±15.57U/ml和133.65±17.80，两组间有显著差异（t=3.079，P<0.003）。 结论 急性期海洛因海绵状白质脑病患者线粒体呼吸链复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性降低，本病可能影响了线粒体相关酶的合成，导致氧化磷酸化障碍，进一步证实线粒体功能障碍在海洛因海绵状白质脑病的发病中起着重要作用这一推断。
关键词：海洛因;白质脑病;线粒体呼吸链;作用
The Role of Mitochondrial Complexes in Heroin Spongiform Leukoencephalopathy
LIANG Li，LIN Minshi， ZHOU Liang
Department of Neurology， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China
Abstract： Objective Study the role of mitochondrial respiratory chain complex II， III， IV in heroin spongiform leukoencephalopathy.Method The activity of mitochondrial respiratory chain complex in peripheral blood from 36 cases of acute heroin leukoencephalopathy patients and normal controls were determined by using enzyme linked immunosorbent assay， compared with standard curve， and calculated the concentration of mitochondrial respiratory chain complex.Result The determinate results of mitochondrial respiratory chain complex II between the control group and heroin group did not accord with normal distribution. There were significant difference between the two groups by the Wilcoxon W test （Z=-4.015.P<0.001）.The results of the mitochondrial respiratory chain complex III were 21.75 ± 5.15U/ml and 17.42 ± 4.02U/ml. there were significant differences between the two groups （t=3.978， P<0.001）.The results of the mitochondrial respiratory chain complex IV were 145.79 ± 15.57U/ml and 133.65 ± 17.80 U/ml. there were significant differences between the two groups （t=3.079， P<0.003）.Conclusion The activity of mitochondrial respiratory chain complex II， III， IV in the acute stage of patients with heroin spongiform leukoencephalopathy are decreased. This disease may affect the synthesis of mitochondrial enzymes， resulting in oxidative phosphorylation disorders，and it is further confirmed that mitochondrial dysfunction play an important role in the pathogenesis of heroin spongiform leukoencephalopathy.
Key words： Heroin; leucoencephalopathy; mitochondrial respiratory chain; role
海洛因海绵状白质脑病 （Heroin spongiform leukoencephalopathy， HSLE）的名字是由海洛因慢性中毒引起脑白质区的海绵状改变而得来，是Wolters EC[1]等于1982年在阿姆斯特丹首次报道。自2000年国内发现本病至今，已对海洛因白质脑病的临床、影像、脑脊液、基因多态性、病理、流行病学及病因学等方面做了深入研究。研究显示，该类患者脑白质病变区乳酸盐水平升高，N-乙酰天门冬氨酸、胆碱下降，经抗氧化及能量合剂治疗有效[2]，同时该患者的线粒体基因组全序列分析发现编码NADH一泛醌还原酶的3个位点均发生了突变[3]，且外周血呼吸链酶复合体I活性下降[4]，表明本病患者在呼吸链酶复合体I已出现了有氧代谢障碍，考虑本病不是慢性缺氧损害过程，最大可能是损害了与有氧代谢有关的线粒体呼吸链，现为了进一步验证以上推测，对其它的线粒体呼吸链酶复合体Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性进行测定，以探讨剩余的线粒体呼吸链复合物在海洛因海绵状白质脑病的作用。
1资料和方法
1.1 一般资料
纳入2000年3月至2012年8月门诊或曾在南方医院神经内科住院的海洛因海绵状白质脑病患者（HSLE组），其中男32例，女4例，年龄20～45岁左右;及在我院体检的健康体检者 （对照组，无成瘾性药物使用史）各36例。
1.2 实验设计 采用酶联免疫分析方法，即纯化的人线粒体呼吸链复合物抗体包被微孔板中依次加入线粒体呼吸链复合物及 HRP标记的线粒体呼吸链复合物抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物TMB显色，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。
1.3 材料与试剂 人线粒体呼吸链复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ酶联免疫分析试剂盒（上海雅浦生物科技有限公司）：微孔酶标板、封板膜2张、自封袋1个、标准品：200 U/mL 1瓶、标准品稀释液1瓶、检测抗体-HRP 1瓶、样品稀释液1瓶、底物A 1瓶、底物B液1瓶、终止液1瓶、20×洗涤缓冲液1瓶。
1.4 标本处理 收集研究对象的清晨空腹EDTA抗凝全血2ml，血液室温自然凝固10～20 min，3000 r/min离心30 min。仔细收集上清，标本放于-20℃保存。
1.5实验方法
1.51从铝箔袋（室温平衡20min后）中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封保存在4℃。
1.52设置样本孔、标准品孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度标准品50μL;空白孔什么都不用加;待测样本孔先用加样器加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL;
1.53 随后在标准品孔和样本孔中（除外空白孔）加入HRP标记的检测抗体50μL，将封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或者恒温箱温育60min。
1.54弃去液体，然后用吸水纸上拍干，在每孔中加满洗涤液，静置1min后甩去洗涤液，用吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（可用洗板机洗板）。
1.55所有孔分别加入底物A、B各50μL（37℃避光），孵育15min。
1.56所有孔分别加入终止液50μL，15min内在450nm波长处分别测定各孔的OD值。
1.57标准曲线制作：以标准物浓度为横坐标，D450值为纵坐标，绘出标准曲线。
1.58样品线粒体呼吸链复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测定（样品浓度）：根据样品的D450值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，也即为样品的实际浓度，即样品线粒体呼吸链复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性。
1.6 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。检验各组变量正态分布情况，非正态分布的变量经秩和检验后再分析;采用F检验进行方差齐性检验，两样本均数比较采用t检验，P
2 结果
2.1两组患者线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性比较
两组研究对象性别、年龄等经统计学分析，无差异（P>0.05）。标准品的稀释与加样按说明书操作，得标准曲线，见图1-1。正常对照组和病患组线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性不符合正态分布，经Wilcoxon W检验统计量为957.5，Mann-Whitney U统计量为291.5，Z=-4.015.P<0.001，两组间有显著差异。
The normal concentration of respiratory chain complex II（U/mL）
图1-1 吸光度的标准曲线
Fig.1-1 The standard curve of Absorbance
2.2两组患者线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性比较
标准品的稀释与加样按说明书操作，得标准曲线，见图1-2。正常对照组和病患组线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性符合正态分布，分别为值17.42±4.02U/ml和21.75±5.15U/ml，经t检验，t=3.978，P<0.001，两组间有显著差异。
The normal concentration of respiratory chain complex III（U/mL）
图1-2 吸光度的标准曲线
Fig.1-2 The standard curve of Absorbance
2.3 两组患者线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性比较
标准品的稀释与加样按说明书操作，得标准曲线，见图1-3。正常对照组和病患组线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性分别为值133.65±17.80和145.79±15.57U/ml，经t检验，t=3.079，P<0.003，两组间有显著差异。
The normal concentration of respiratory chain complex IV（U/mL）
图1-3 吸光度的标准曲线
Fig.1-3 The standard curve of Absorbance
3 讨论
线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所。线粒体内膜上存在有按一定顺序排列的酶和辅酶，即线粒体呼吸链。它在线粒体发生氧化磷酸化和生成ATP过程中的起到重要作用，可拆分成四个具有传递电子功能的酶复合体，分别是酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，它们分别是NADH-辅酶Q还原酶，琥珀酸-辅酶Q还原酶，泛醌-细胞色素C还原酶，细胞色素C氧化酶。任何酶复合体缺陷均可导致线粒体内膜质子电化学梯度变化，导致ATP合成障碍及增加氧自由基损伤，从而导致乳酸堆积，引起脑部重要组织的损伤。
在研究运动对小鼠骨骼肌线粒体复合体影响的实验中发现，随着年龄的增长，骨骼肌线粒体复合酶I（NADH脱氢酶）活性明显下降，而线粒体复合酶Ⅳ（细胞色素氧化酶）在活性上无显著改变。有研究显示辅酶Q-细胞色素C还原酶还是抗原虫、杀真菌剂、抗癌药物及抗疟疾药物―氯胍、阿托喹酮、布帕伐醌的作用靶标[6-7]，较容易受到环境药物而被影响酶活性。有关海洛因白质脑病患者线粒体呼吸链复合物I相关基因研究显示海洛因白质脑病患者46%存在着线粒体呼吸链复合物I相关基因的突变[8]，但是未能排除存在其它的基因突变位点可能，还发现该病患者线粒体复合酶I（NADH脱氢酶）活性明显下降，该病有无其他复合物的病变，仍需进一步实验以了解线粒体复合物II、III、IV活性情况，以进一步明确海洛因白质脑病的发病机制。 本次研究通过对比正常人与海洛因海绵状白质患者外周血白细胞线粒体呼吸链复合物II、III、IV活性，结果显示海洛因海绵状白质脑病组线粒体呼吸链复合物II、III、IV活性低于正常对照组，说明该病线粒体呼吸链复合物活性均受到影响，而活性间接或者直接反映患者线粒体呼吸功能的变化，进一步证实线粒体功能障碍在海洛因海绵状白质脑病的发病中起着重要作用这一推断，进一步推测本病可能的发病机制为：海洛因海绵状白质脑病是一种中毒代谢性疾病，毒物导致线粒体功能受损，继而出现能量代谢障碍[9-10]，对缺氧敏感的脑组织出现广泛的白质继发脱髓鞘。
参考文献： [1]Wolters EC， van Wijngaarden GK， Stam FC， et al. Leucoencephalopathy after inhaling "heroin" pyrolysate[J]. Lancet， 1982， 2（8310）： 1233-7.
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课题来源：广东省科技基金（2012B031800472）
作者简介：梁莉，E-mail：
林敏仕，E-mail： 。
通讯作者，周亮，博士，副教授，主任医师， E-mail： 。