异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞TGF-β受体影响的实验研究

摘 要：目的:探讨经不同浓度异补骨脂素干预对小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3-E1）增殖、Ⅰ型骨胶原的表达、tgf-βⅠ、Ⅱ型受体的影响以及与原发性骨质疏松症的关系。方法：细胞分为正常对照组与不同浓度异补骨脂素组。各组细胞采用MTT方法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,天狼星红染色法测定Ⅰ型骨胶原的表达，荧光素酶报告基因检测TGF-β1通路活性以及Western-Blot法检测TGF-βⅠ、Ⅱ型受体的表达。结果：经不同浓度异补骨脂素刺激，可明显促进MC3T3-E1细胞增殖（P

关键词：骨质疏松症；报告基因；TGF-βⅠ、Ⅱ型受体；Ⅰ型胶原

中图分类号：R285.5文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0820-03

The experimental effect of Isopsoralen on TGF-β receptors of mouse preosteoblasts

TA Na【sup】1，2【/sup】，TAN Ming-sheng【sup】1，2【/sup】，YI Ping【sup】2【/sup】，JIANG Xin【sup】2【/sup】，YANG Feng【sup】2【/sup】，TANG Xiang-Sheng【sup】2【/sup】

（1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China2.China-Japan Friendship Hospital，BeiJing 100029，China）

Abstract:Objective：To investigate the effect of different concentrations of isopsoralen on cell proliferation, expression of type Ⅰcollagen,and TGF-β Ⅰ, Ⅱtype receptors of mouse preosteoblasts （MC3T3-E1） as well as the relationship between primary osteoporosis.Methods：Cells were divided into normal group and different concentration of isopsoralen groups.Cells proliferation was detected by MTT methodSirius red staining was used to detect the expression of type ⅠcollagenThe activity of TGF-β1 passway was detected by luciferase reporter geneAnd Western-Blot for testing TGF-βⅠ, Ⅱtype receptors in each groups. Result：After stimulation of different concentration of isopsoralen, The cells proliferation were apparently promoted（P

Key words:osteoporosis；Report gene；TGF-βⅠ Ⅱreceptor；TypeⅠcollagen

收稿日期：2010-11-16

基金项目：首都医学发展科研基金资助项目（2002-3076）；中日友好医院院内配套资金

作者简介：塔娜（1979-），女，博士研究生，研究方向：中西医结合骨科。

通讯作者：谭明生（1958-），男,教授、主任医师,博士研究生导师，研究方向：脊柱外科。

原发性骨质疏松症（Primary Osteoporosis，POP）是一种增龄性全身骨骼退变疾病。骨质疏松病理改变主要涉及成骨细胞骨形成减少与破骨细胞骨吸收增加导致人体骨量减少和骨密度（BMD）降低。据2006年的流行病学调查，我国60岁以上老年人中骨质疏松症的发病率较40岁以上人群明显增高，女性尤为突出【sup】［1］【/sup】。妇女雌激素水平下降是导致绝经后骨质疏松症的主要原因。雌激素补充疗法是预防、治疗绝经后骨质疏松症的首选疗法【sup】［2］【/sup】。转化生长因子β（TGF-β）是一种细胞活动的多功能调节肽，据靶细胞不同发挥促进或抑制增殖的调节作用。TGF-β主要通过TGF-βⅠ、Ⅱ型丝氨酸／ 苏氨酸激酶受体复合物及细胞质内的下游信号传导分子Smads蛋白家族成员发挥生物作用。TGF-β由具有成骨作用的细胞合成和分泌，并以自分泌的形式调节这些细胞的功能【sup】［3］【/sup】。TGF-β对细胞外基质具有重要的调节作用，Ⅰ型胶原为骨基质主要成分，由成骨细胞合成分泌，是骨组织的重要成分之一，骨质疏松时成骨细胞数量减少并伴有骨胶原合成降低。补骨脂为补肾助阳类中药，是防治原发性骨质疏松症中药复方常见组份之一。异补骨脂素是从补骨脂中提取的香豆素类化合物，已有研究证明其具有雌激素样活性，但无雌激素样不良反应。目前很少有关于异补骨脂素防治骨质疏松机制方面的研究报道。为此，本文从细胞水平观察了异补骨脂素对成骨细胞增殖及骨胶原基质的影响以及对TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体的作用，旨在探讨异补骨脂素防治原发性骨质疏松症的作用机制，为异补骨脂素的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

实验细胞： MC3T3-E1、293T细胞购自协和医科大学细胞中心。

1.2 主要试剂与药品

异补骨脂素 中国生物药品检定所。DMEM培养基购自中国医学科学院细胞中心，胎牛血清购自Hyclone公司，硫酸链霉素、青霉素（Hyclone 公司）。MTT购自Sigma公司，DMSO，0.25%胰蛋白酶溶液，天狼星红染液购自Electronic Microscopy Sciences,一抗TGF-βI、TGF-βII（sc-398，sc-400）及二抗购自Santa公司，转染试剂LipofectAMINETM 2000；双荧光素酶报告基因（购自Invitrogen公司）。

2 实验方法

2.1 MTT法检测正常对照组及不同浓度异补骨脂素组MC3T3-E1细胞增殖情况

采用MTT法，以1×10【sup】4【/sup】/孔将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，应用无血清培养液培养24h，分别加入经含无水乙醇培养液配制的不同浓度异补骨脂素溶液（10【sup】2【/sup】、10【sup】1【/sup】、10【sup】0【/sup】、10【sup】-1【/sup】、10【sup】-2【/sup】、10【sup】-3【/sup】、10【sup】-4【/sup】、10【sup】-5【/sup】、10【sup】-6【/sup】μM）每组设6个复孔，并设相应正常对照组进行比较，并在培养72时，每组加入MTT至终度为0.5mg/ml；继续培养4h，去除培养液，加入200μlDMSO溶解沉着的色素染料10分钟，上酶标仪检测490nm光吸收值。

2.2 天狼星红染色测定细胞层的胶原含量

去除96孔板中的培养液，－20℃甲醇固定细胞过夜，PBS洗1遍；0.1%天狼星红室温染色1h，去除染液，用0.1%冰醋酸洗3遍，每次5min；每孔加入0.1mol/L氢氧化钠200μL，室温作用1h，振荡混匀，于540nm测光吸收值检测胶原【sup】［4］【/sup】。

2.3 细胞分组

传代细胞分传为5盘细胞（60mm dish细胞培养皿），细胞融合达60%时，吸出每瓶废液；4mL无血清 DMEM，继续置孵箱孵育，同步24h，使细胞静止于Go；每盘为一组，分为五组：正常组、不同浓度异补骨脂素组。正常组，正常培养；不同浓度异补骨脂素组，含有不同浓度异补骨脂素的培养基培养。各组细胞置37℃、5%CO【sub】2【/sub】孵育箱培养，72h后提取总蛋白。

2.4 荧光素酶报告基因

荧光素酶报告基因（12×CAGA）【sup】［5］【/sup】；按照LipofectAMINETM 2000 提供的方法分别转染293T细胞。转染24 h后，同时分别给予不同浓度的异补骨脂素刺激12h后收获细胞，在荧光酶报告分析仪（Top Count）专用的检测板（一种96 孔板）每个孔中依次加入荧光酶催化底物I，Ⅱ以及上述细胞裂解物，并混匀。利用相应软件程序进行荧光酶活性测定，统计分析，绘图。

2.5 Western bloting检测

2.5.1 细胞浆蛋白提取 小鼠胚胎前成骨细胞（MC3T3-E1）在10%小牛血清DMEM培养传代。于实验前采用无血清DMEM同步24 h,然后以终浓度分别为0、10【sup】-1【/sup】、10【sup】-2【/sup】、10【sup】-3【/sup】、10【sup】-4【/sup】μM含药培养基孵育72h,正常对照组不加异补骨脂素。于实验终点分别提取胞浆蛋白,每瓶加入200μL胞浆裂解液冰上裂解30min,用细胞刮刮下细胞移入一预冷EP管中,4℃下离心20000 r/min×5min立即将上清液移入一预冷EP管中与等体积上样缓冲液混匀后100℃煮沸10min，-20℃备用。

2.5.2 步骤 取等体积上述变性蛋白液，于SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离,其中分离胶与浓缩胶浓度分别为10%、4%。然后将胶进行电转膜,取出膜后4℃封闭过夜加入抗人TGF-β1I,Ⅱ型一抗（sc-398，sc-400）,4℃过夜。TBST洗10min×3加二抗37℃孵育1h。再次洗膜后ECL（Thermo）显色, x光胶片曝光后，图片结果进行统计分析。

2.6 统计学方法

利用ImageJ分析软件对结果进行图像分析。各组图像分析结果采用（±s）表示,所有实验数据均采用统计软件SPSS 11.0进行单因素方差分析,P

3 结 果

3.1 MTT法检测异补骨脂素对MC3T3-E1细胞增殖的影响

表1 72h异补骨脂素对成骨细胞增殖的

促进490nm紫外吸收A值（±s）

注：各加药组与同时对照组（异补骨脂素浓度为0μM）比较，P

MTT结果见表1，对照组细胞排列整齐贴壁生长；用药组细胞亦排列整齐贴壁生长。于72h,异补骨脂素从10【sup】-4【/sup】μM至10【sup】-1【/sup】μM时，能显著促进MC3T3-E1增生（P

3.2 天狼星红染色观察异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞胶原成分的影响

表2 异补骨脂素干预72h对成骨细胞层胶原合成的

促进540nm紫外吸收A值（±s）

胶原测定结果：胶原经天狼猩红染色后检测结果见表2，异补骨脂素不同程度促进MC3T3-E1细胞分泌Ⅰ型胶原，不同剂量组之间均有统计学意义（P

3.3 异补骨脂素对各组细胞TGF-β1通路活性的影响

与正常对照组相比各异补骨脂素干预组均可明显激活TGF-β1报告基因，其中以10【sup】-3【/sup】μM异补骨脂素刺激组对荧光素酶表达活性的影响最强，而10【sup】-4【/sup】μM异补骨脂素组则有所减弱。

3.4 异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞转化生长因子βⅠ、Ⅱ型受体蛋白的影响

注：1：正常组；2：异补骨脂素10【sup】-1【/sup】μM组；3：异补骨脂素10【sup】-2【/sup】μM组；4：异补骨脂素10【sup】-3【/sup】μM组5：异补骨脂素10【sup】-4【/sup】μM组。

表3 MC3T3-E1细胞72h胞浆蛋白

TβRI、TβRⅡ图像分析结果（±s）

TβRI 与 TβRII的Western bloting实验结果进行图像分析显示：与正常组相比异补骨脂素作用于MC3T3-E1细胞72 h可明显促进TβRI 与 TβRII表达（P

4 讨 论

成骨细胞数量减少和合成细胞基质成分的功能降低是骨质疏松的主要病理改变之一，可受雌激素缺乏和细胞因子调节改变等多种因素的影响。成骨细胞功能和数量的改变，造成骨形成最佳条件缺陷，必将导致骨组织结构及力学特征的改变【sup】［6］【/sup】，从而导致多种骨质疏松性骨折。此外，在复杂的骨代谢调控网络中，已有研究证实细胞因子TGF-β及其信号通路在骨重建中发挥重要作用【sup】［7］【/sup】。Thirunavukkarasu K等【sup】［8］【/sup】在实验研究中证明TGF-β可通过促进骨保护素（OPG）基因表达而抑制骨吸收并可促进成骨细胞增殖和分泌细胞外基质而有抗骨质疏松作用。G.E.Krassas等【sup】［9］【/sup】的研究表明在体内雌激素可明显刺激骨中TGF-β基因转录与合成，对骨重建有着重要的作用。雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症主要病因，雌激素替代疗法（HRT）是治疗该类骨质疏松症的主要方法之一。但由于雌激素的诸多不良反应，近年来人们已逐渐将目光转向应用中医药防治骨质疏松。

异补骨脂素是中药补骨脂中提取的香豆素类化合物,具有雌激素样活性,但无雌激素样不良反应【sup】［10］【/sup】。近年来关于植物雌激素类药物对成骨细胞及细胞外基质和TGF-β信号通路方面的研究鲜见报道，这方面的研究可为合理采用中医药防治骨质疏松提供理论基础。原发性骨质疏松症涉及细胞信号通路以及成骨细胞和细胞外基质（ECM）成分的变化。骨组织中TGF-β可由成骨细胞分泌，TGF-β参与组织修复与其他病理生理过程，是一种组织内存在广泛的信号传导路径。其中TGF-β1为具有多种生物学功能的活性肽，在骨质疏松症发病过程中的作用越来越受到关注。

我们的试验发现，异补骨脂素可明显促进体外培养小鼠胚胎前成骨细胞增殖、Ⅰ型骨胶原的分泌以及刺激TGF-β1活性并有TGF-βⅠ、Ⅱ型受体蛋白表达增加，推测植物雌激素异补骨脂素可通过TGF-β信号通路来促进成骨细胞增殖及胶原基质的合成，从而发挥抗骨质疏松作用。但是对其作用机制仍需要进行深入研究，从而为临床更好地采用中医药防治绝经后骨质疏松症提供理论支持。

参考文献

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