UPLCPDA同时测定藏药翼首草环烯醚萜苷和酚酸类10个化学成分的含量

[摘要] 建立超高效液相色谱法（UPLCPDA）同时测定藏药翼首草环烯醚萜和酚酸类10个化学成分的含量。采用Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）色谱柱，流动相0.2%磷酸水（A）乙腈（B），梯度洗脱，检测波长237，325 nm，流速0.4 mL・min-1，柱温30 ℃，进样量1 μL。研究结果表明UPLCPDA法定量分析翼首草10个化学成分在考察的范围内线性关系良好（r≥0.999 7）；加样回收率为96.30%～103.0%（n=9），RSD为0.72%～2.9%（n=9）。所建立UPLC方法简便、准确、重复性好，可同时测定藏药翼首草中10个化学成分的含量。

[关键词] 藏药； 翼首草； UPLCPDA； 环烯醚萜； 酚酸； 含量测定

Simultaneous determination of ten major compounds including iridoid

glycosides and phenolic acids in Pterocephalus hookeri by UPLCPDA

TANG Ce1， WEN Jian1， WANG Jing1， ZHAO Kehui1， FAN Gang1， MENG Xianli1， ZOU Zhongmei2， ZHANG Yi1*

（1.College of Ethnic Medicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；

2.Institute of Mechcinal Plant Development， Chinese Acadeuy of Medical Scieuce and Peking Union Medical

College， Beijing 100193， China）

[Abstract] This study is to develop an UPLCPDA method for determination of 10 major components in Pterocephalus. The UPLCPDA assay was performed on a Waters Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）， and the column temperature was at 30 ℃. The mobile phase consists of water containing 0.2% phosphoric acid （A） and acetonitrile （B） in gradient elution at a flow rate of 0.4 mL・min-1. The detection wave length was set at 237 and 325 nm， and the injection volume was 1 μL in the UPLC system. The linear range of 10 detected compounds were good （r≥0.999 7）， and the overall recoveries ranged from 96.30% to 103.0%， with the RSD ranging from 0.72% to 2.9%. The method was simple， accurate and reproducible， which can be used for the simultaneous determination of the content of ten major components in P. hookeri.

[Key words] Tibetan medicine； Pterocephalus hookeri； UPLCPDA； iridoid glycoside； phenolic acid； content determination

翼首草（藏Z名：榜孜毒乌）为川续断科匙叶翼首草Pterocephalus hookeri（C.B.Clarke）Heck 的干燥全草，收载于2015年版《中国药典》（一部）[1]及卫生部《藏药部颁标准》[2]中，为常用藏药。翼首草主要含有环烯醚萜类和皂苷类成分，如马钱苷、吴茱萸苷、齐墩果酸和熊果酸等[39]，具有抗病毒、抗氧化及提高免疫力等作用。课题组前期对翼首草进行了LCQTOFMS的化学成分分析，首次发现翼首草中含有大量的马钱苷酸、异绿原酸A、异绿原酸C、林生续断苷Ⅰ、续断苷B和续断苷A，且这些化学成分具有较强的紫外吸收。因此，本文采用UPLCPDA对其环烯醚萜和酚酸类10个化学成分进行含量测定，为翼首草的质量控制提供新的科学依据。

1 材料

Waters Acquity UPLCTM超高效液相色谱仪，包括四元溶剂管理系统、样品管理系统、PDA检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；BT125D 1/10万电子天平（德国Sartorius公司）；KQ500E超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。

马钱苷酸（111865201102）、绿原酸（110753201413）和马钱苷（111640201509）购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A（16031611）、异绿原酸C（16031613）购自成都曼思特生物科技有限公司；獐牙菜苷、林生续断苷Ⅰ、吴茱萸苷、续断苷B和续断苷A由本实验室分离制备；经光谱及高效液相色谱分析确认，纯度均在98%以上。HPLC级甲醇、乙腈（美国J.T.Baker公司），水为屈臣氏蒸馏水（可供UPLC/UPLCMS测定）；HPLC级甲酸（美国Tedia公司）。甲醇、磷酸试剂均为分析纯。

翼首草药材16批见表1，自采于四川、云南，经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为川续断科匙叶翼首草P. hookeri的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相0.2%磷酸水（A）乙腈（B），梯度洗脱（0～4 min，10%～12%B；4～5 min，12%～17%B；5～10 min，17% B；10～14 min，17%～25% B；14～15 min，25% B），检测波长237，325 nm，流速0.4 mL・min-1，柱温30 ℃，进样量1 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取翼首草粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取马钱苷酸、绿原酸、獐牙菜苷、马钱苷、异绿原酸A、林生续断苷Ⅰ、异绿原酸C、吴茱萸苷、续断苷B和续断苷A对照品适量，加70%甲醇溶液制成每1 mL含马钱苷酸0.159 mg、绿原酸0.305 mg、獐牙菜苷0.175 mg、马钱苷1.101 mg、异绿原酸A 0.253 mg、林生续断苷 Ⅰ0.385 mg、异绿原酸C 0.138 mg、吴茱萸苷1.385 mg、续断苷B 0.065 mg和续断苷A 0.130 mg溶液。

2.3 线性关系考察

精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液，按不同比例加入70%甲醇溶液稀释，制成一系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件测定。以对照品浓度（mg・L-1）（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，见表2。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取2.2.2项下制备的混合对照品溶液1 μL，按2.1项下的色谱条件，重复进样6次，测定10个化学成分的峰面积，结果计算马钱苷酸、绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、异绿原酸A、林生续断苷 Ⅰ、异绿原酸C、吴茱萸苷、续断苷B和续断苷A的RSD分别为0.43%～0.91%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批次（S16）供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24 h，按2.1项下的色谱条件测定，结果计算得马钱苷酸、绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、异绿原酸A、林生续断苷 Ⅰ、异绿原酸C、吴茱萸苷、续断苷B和续断苷A的RSD均在0.59%～3.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批次（S16）的翼首草药材粉末6份，按2.2.1项下制备翼首草供试品溶液，按照上述条件分别进样，测定翼首草供试品溶液10个化学成分的峰面积，计算得马钱苷酸、绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、异绿原酸A、林生续断苷Ⅰ、异绿原酸C、吴茱萸苷、续断苷B和续断苷A的RSD均在1.4%～4.3%，表明重复性良好。

2.4.4 加样回收率试验 取已知含量的翼首草药材粉末9份，每份约0.25 g，分别加入适量的混合对照品溶液，按2.2.1项下方法制备，按2.1项下色谱条件测定，计算马钱苷酸、绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、异绿原酸A、林生续断苷Ⅰ、异绿原酸C、吴茱萸苷、续断苷B和续断苷A的回收率在96.30%～103.0%，RSD在0.72%～2.9%，见表3。

2.5 样品含量测定

分别取不同批次的翼首草药材，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，计算马钱苷酸、绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、异绿原酸A、林生续断苷Ⅰ、异绿原酸C、吴茱萸苷、续断苷B和续断苷A的含量。UPLC见图1，含量测定结果见表4。

3 讨论

本文考察了Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Acquity UPLCR HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色谱柱对10个化学成分离效果，结果Acquity UPLCR BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱分离效果最佳。

本文建立了同时快速测定藏药翼首草环烯醚萜和酚酸类10个化学成分含量的方法，出峰时间减少为15 min，10个化学成分中马钱苷酸、异绿原酸A、异绿原酸C、续断苷A和续断苷B为首次从翼首草药材中测到。通过UPLCPDA发现，酚酸类成分：绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C在325 nm具有最大吸收，其他7个环烯醚萜类成分在237 nm处有最大吸收，故本验在237，325 nm处分别作为检测波长。

量测定，发现每批翼首草中含量相对最高的均是吴茱萸苷，其中四川省阿坝县麦昆乡草原社的翼首草中吴茱萸苷最高，为63.97 mg・g-1，各产地样品中续断苷A含量均高于续断苷B，其他化合物的含量也不尽相同。

2015年版《中国药典》（一部）中以齐墩果酸和熊果酸的含量为指标，规定翼首草药材中含齐墩果酸和熊果酸的总量不得少于0.20%。从表4可发现，翼首草中含有的环烯醚萜和酚酸类成分远远高于0.20%，而且齐墩果酸和熊果酸在大量的植物中含有，其专属性差。因此，2015年版《中国药典》（一部）中翼首草的质控标准是否恰当，值得深入研究。

[参考文献]

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