葛根素减轻PM25对血管内皮细胞损伤的机制研究

[摘要] 探讨PM25对EAhy926型人脐静脉内皮细胞损伤的影响及葛根素的保护作用及机制。采集大气PM25分别以0，20，200，400 mg・L-1染毒EAhy926细胞24 h，MTT法测细胞存活率，流式细胞术测细胞凋亡，Western blot法测pERK1/2，Bax，Bcl2蛋白水平，ELISA法测肿瘤坏死因子α（TNFα）及白细胞介素6（IL6）含量，并测细胞丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及乳酸脱氢酶（LDH）活性；分别加入葛根素（10，50，100 μmol・L-1）和ERK1/2通路特异性阻滞剂PD98059 20 μmol・L-1检测葛根素的干预作用及机制。检测发现与对照组比较，PM25染毒后呈剂量依赖性降低EAhy926细胞存活率，上调pERK1/2蛋白水平及Bax/Bcl2蛋白比率以促进细胞凋亡，诱导分泌TNFα及IL6含量增高，降低SOD活性，增加MDA含量及LDH活性（P

[关键词] 大气细颗粒物；葛根素；细胞外信号调节蛋白激酶1/2；血管内皮细胞

Puerarin attenuates PM25induced vascular endothelial cells

injury via ERK1/2 signaling pathway

WAN Qiang1*， YANG Yuping2， LIU Zhongyong1

（1. Department of Medical Cardiology， the Affiliated Hospital of Jiangxi University of

Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China；

2. Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Hospital of Jiangxi University of

Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China）

[Abstract] To investigate the effect and the mechanism of puerarin in attenuating PM25induced human umbilical vein endothelial cells （EAhy926） injury， the samples of fine particulate matter （PM25） were collected and made into suspension Different concentrations of PM25 （0，20， 200， 400 mg・L-1） were used to contaminate EAhy926 cells for 24 h The cells survival rate was detected by MTT assay； cells apoptosis of EAhy926cells was detected by flow cytometry； the protein levels of pERK1/2， Bax and Bcl2 were detected by Western blot； the contents of tumor necrosis factorα （TNFα）， interleukin6 （IL6）， malonaldehyde （MDA）， and the activities of superoxide dismutase （SOD） and lactic dehydrogenase （LDH） were measured by ELISA Puerarin at different concentrations （10， 50， 100 μmol・L-1） or a specific inhibitor of ERK1/2 pathway PD98059 （20 μmol・L-1） was added into the EAhy926 cells to observe the intervention effect and mechanism of puerarin Compared with the control group， PM25 reduced the cells survival rate， upregulatedpERK1/2 protein level and Bax/Bcl2 ratio in a dose dependent manner to promote apoptosis； increased the contents of TNFα， IL6 and MDA， the activity of LDH， but decreased SOD activity in the EAhy926 cells （P

[Key words] fine particulate matter； puerarin； extracellular signalregulated protein kinase 1/2； vascular endothelial cells

doi：10.4268/cjcmm20161223

动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）是心血管疾病的重要病理基础，对人类健康造成严重危害。血管内皮细胞损伤被视为AS始动病理环节[1]。吸入大气中空气动力学直径≤25 μm的细颗粒物（fine particulate matter， PM25）可促进AS形成[23]。葛根素（puerarin）是从葛属植物野葛或甘葛藤根部提取的异黄酮类化合物，可通过抑制炎症反应、抗氧化应激损伤、调节脂质代谢、抑制血管新生等多途径发挥抗AS效应[4]，但其机制尚未完全阐明。本实验观察PM25对EAhy926型人脐静脉内皮细胞损伤的影响，加用葛根素和细胞外信号调节蛋白激酶1/2（extracellular signalregulated protein kinase 1/2，ERK1/2）信号通路特异性阻滞剂PD98059干预，探讨葛根素对PM25损伤EAhy926细胞的干预作用及可能机制。

1 材料

11 细胞株

EAhy926细胞株购自美国ATCC细胞库，增殖周期约为31 h，批号2922。

12 药物与试剂

葛根素购自南京泽朗医药科技有限公司，纯度99%，批号ZL201504021A；二甲基亚砜（DMSO）和噻唑蓝（MTT）均购自美国Sigma公司；胎牛血清和DMEM培养基均购自美国Gibco公司；pERK1/2，Bcl2，Bax和βactin抗体均购自美国Cell Signal Technology公司；Annexin VFITC试剂盒购自美国Bio Vision公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）和白细胞介素6（interleukin6，IL6）ELISA试剂盒购于美国eBioscience公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），丙二醛（malonaldehyde，MDA）和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase， LDH）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

13 仪器

3111型恒温细胞培养箱，MK3型酶标仪和ST16R型低温高速离心机均购自美国Thermo公司；1651801型电泳仪购自美国BioRad公司；TY7350型流式细胞仪购自美国ACEA Biosciences公司；IX71型荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司。

2 方法

21 PM25的采集与制备

参照广州市环保局提供的空气质量指数和PM25监测数据，于空气质量指数5级及以上的PM25严重超标的雾霾天气，在广州市距离地面约50 m高建筑楼顶用MiniVol型便携式PM25采样器（美国Airmetrics公司）以流量为5 L・min-1进行24 h・d-1采样，连续采样3 d。将石英纤维滤膜（美国Whatman公司）剪成1 cm×3 cm大小置于去离子水，超声震荡30 min×3次，提取液用6层无菌纱布过滤，以1万 r・min-1于4 ℃离心20 min，收集提取物真空冷冻干燥成干粉，称重，于-20 ℃避光保存。用灭菌PBS配制成质量浓度分别为20，200，400 mg・L-1的PM25混悬液。

22 细胞分组及处理

设PM25不同质量浓度组，分别以0，20，200，400 mg・L-1 PM25作用EAhy926细胞24 h[5]。药物干预组设①对照组；② PM25组：200 mg・L-1PM25混悬液染毒24 h；③～⑤分别为PM25+葛根素低剂量组、PM25+葛根素中剂量组、PM25+葛根素高剂量组：分别以10，50，100 μmol・L-1葛根素预处理细胞1 h[6]后再加200 mg・L-1PM25染毒24 h；⑥ PM25+PD98059组：20 μmol・L-1PD98059预处理细胞30 min[7]后再加200 mg・L-1PM25染毒24 h。

23 MTT法检测细胞存活率

EAhy926细胞密度调至每孔1×104个接种至96孔培养板，每组设6个复孔，培养24 h后撤去血清。不同质量浓度PM25混悬液染毒后加入20 μL MTT溶液（PBS溶解，质量浓度为5 g・L-1）室温培养4 h，每孔加150 μL DMSO使还原产物完全溶解，低速振荡10 min，酶标仪测波长570 nm处各孔吸光度A。细胞存活率=（A实验组-A空白对照组）/（A对照组-A空白对照组）×100%。

24 流式细胞术检测细胞凋亡

EAhy926细胞密度调至每孔2×105个接种至12孔培养板24 h，每组设6个复孔，加不含血清的培养液培养24 h。收集细胞，PBS洗涤5 min×2次，加Annexin VFITC及PI双染，流式细胞术检测细胞凋亡。

25 EAhy926细胞TNFα，IL6及MDA含量，SOD及LDH活性的测定

取对数生长期的EAhy926细胞以1×105个/mL接种于培养皿。收集细胞，以1 000 r・min-1离心10 min，去除培养液，以2 mL PBS洗1次后加PBS 500 μL混悬。超声5 s×5次，使细胞破碎，黄嘌呤氧化酶法检测细胞裂解液中SOD活性。收集细胞上清液，ELISA法检测TNFα及IL6含量，硫代巴比妥法检测MDA含量，比色法检测LDH活性，操作步骤参照说明书进行。

26 Western blot法检测Bax，Bcl2，pERK1/2蛋白水平

提取EAhy926细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，煮沸5 min蛋白变性后进行SDSPAGE凝胶电泳，半干转印，5%脱脂牛奶封闭2 h，加一抗（1∶1 000稀释）于4 ℃反应过夜，TBST洗膜3次，加二抗（1∶2 000稀释）于室温结合，TBST洗膜3次，化学发光检测。以βactin做内参蛋白，Quantity One软件分析各条带吸光度。

27 统计学处理

数据分析采用SPSS 130软件，实验数据采用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较采用Bonferroni法，P

3 结果

31 PM25对EAhy926细胞的影响

311 对EAhy926细胞存活率的影响 与对照组比较，200，400 mg・L-1 PM25染毒24 h均可显著降低EAhy926细胞存活率（P

312 对EAhy926细胞凋亡的影响 与对照组比较，200，400 mg・L-1 PM25染毒24 h均可显著诱导EAhy926细胞凋亡（P

313 对EAhy926细胞TNFα，IL6及MDA含量，SOD及LDH活性的影响 与对照组比较，200，400 mg・L-1 PM25染毒24 h均可显著降低EAhy926细胞内SOD活性（P

314 对EAhy926细胞内Bax，Bcl2及pERK1/2蛋白水平的影响 与对照组比较，200，400 mg・L-1 PM25染毒24 h均可显著增加EAhy926细胞内Bax及pERK1/2蛋白水平，并显著减少Bcl2蛋白水平，增加Bax/Bcl2蛋白比率（P

32 葛根素对PM25损伤EAhy926细胞的干预作用

321 对PM25降低EAhy926细胞存活率的干预作用 与PM25组比较，50，100 μmol・L-1葛根素和20 μmol・L-1 PD98059对于PM25降低EAhy926细胞存活率均有显著的拮抗作用（P

322 对PM25诱导EAhy926细胞凋亡的干预作用 与PM25组比较，50，100 μmol・L-1葛根素和20 μmol・L-1 PD98059均可显著减少由PM25诱导的EAhy926细胞凋亡（P

323 对PM25影响EAhy926细胞TNFα，IL6及MDA含量，SOD及LDH活性的干预作用 与PM25组比较，50，100 μmol・L-1葛根素和20 μmol・L-1 PD98059均可显著增加EAhy926细胞内SOD活性，显著降低细胞上清液中TNFα，IL6，MDA含量及LDH活性（P

324 对PM25影响EAhy926细胞内Bax，Bcl2及pERK1/2蛋白水平的干预作用 与PM25组比较，50，100 μmol・L-1葛根素和20 μmol・L-1 PD98059均可显著降低EAhy926细胞内Bax及pERK1/2蛋白水平，并显著增加Bcl2蛋白水平，减少Bax/Bcl2蛋白比率（P

4 讨论

PM25主要来源于汽车尾气、化石燃料燃烧及香烟烟雾等，大量化学物质、细菌、病毒吸附于PM25表面可经呼吸穿透肺泡进入肺组织间隙，随着循环系统扩散至微血管作用于血管内皮。受损的内皮细胞在氧化应激和炎症刺激下可吸附单核细胞，吞噬脂质成为泡沫细胞，形成脂质斑块，使动脉管腔狭窄，管壁失去弹性形成AS，因此，血管内皮细胞功能损伤被视为AS起始改变[1]。多中心、多种族临床对照试验证实长期慢性暴露在高浓度PM25环境中可通过炎症反应、氧化应激、交感神经兴奋性增加等机制，增加动脉内膜中层厚度、降低AS斑块稳定性，促进此人群AS的形成及发展[23]。动物研究亦发现接触高浓度PM25可上调清道夫受体CD36的表达，诱导粥样斑块内巨噬细胞内胆固醇堆积；增加内脏脂肪素表达；促进炎症及氧化应激反应，加速易损斑块的不稳定及破裂等而促进AS的形成[89]。

氧化和抗氧化系统之间的平衡是维持内皮细胞功能的关键因素。SOD是细胞内的抗氧化酶，可通过清除超氧阴离子减轻活性氧（reactive oxygen species，ROS）损害从而保护内皮细胞，其活性的高低可反映机体抗氧化损伤能力。脂质在自由基作用下可发生过氧化反应，其不饱和脂肪酸氧化终产物为MDA，可引起核酸及蛋白质等生命大分子交联聚合，产生细胞毒性，MDA含量的高低可反映内皮细胞氧化损伤的严重程度。LDH存在于内皮细胞，当细胞受损时细胞膜结构和细胞质内氧依赖性酶受到影响，细胞膜通透性增加，细胞外液LDH漏出量相应增加，因此LDH含量的高低可反映内皮细胞损伤程度。TNFα及IL6在AS慢性炎性中扮演了重要角色，对巨噬、单核细胞的迁移和激活起了调控作用，并能促进血管平滑肌细胞增殖，从而参与AS形成[10]。在Bcl2基因家族蛋白中的促凋亡基因蛋白Bax和抑凋亡基因蛋白Bcl2，Bax/Bcl2比值的高低对细胞凋亡起了直接的调控作用[11]。本研究显示PM25染毒EAhy926细胞后，可显著降低细胞内SOD活性，增加细胞上清液中TNFα，IL6，MDA含量及LDH活性，显著降低EAhy926细胞存活率、增加细胞内Bax/Bcl2蛋白比率以促进细胞凋亡，证实PM25可通过氧化应激损伤及炎症反应途径诱导EAhy926细胞损伤。

氧化应激及炎症均可激活细胞内的细胞凋亡信号级联通路以诱导细胞凋亡。ERK1/2通路是丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPKs）家族分支之一，在构建细胞骨架、维持细胞形态、调节细胞增殖及凋亡等生物学进程中起了重要作用，该通路的激活可通过增加血管平滑肌细胞增殖及炎性因子浸润等促进AS形成[12]。本研究显示PM25染毒可显著增加EAhy926细胞内pERK1/2蛋白水平，证实PM25诱导EAhy926细胞损伤，可能与激活ERK1/2通路有关。

葛根素可通过抑制核转录因子（nuclear factor kappa B，NFκB）信号通路降低C反应蛋白（Creactive protein，CRP）分泌而抗炎、抑制活性氧的产生而抗氧化应激损伤、抑制蛋白激酶B内皮型一氧化氮合酶（protein kinase Bendothelial nitric oxide synthase，PKBeNOS）信号通路而减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤、减少平滑肌细胞增生而抑制血管新生、减少巨噬细胞内胆固醇外流而调节脂质代谢等多途径发挥抗AS作用[1315]。PD98059可抑制ERK的上游激酶，并与非活化形式的MAPK激酶（MAP kinase，MKK）结合以抑制MKK的激活与磷酸化，发挥特异性阻断ERK1/2信号通路的作用。本研究结果证实，与PM25组比较，葛根素及PD98059均可不同程度拮抗PM25降低EAhy926细胞存活率、降低Bax/Bcl2基因蛋白比率以抑制EAhy926细胞凋亡、降低EAhy926细胞内pERK1/2蛋白水平、增加EAhy926细胞内SOD活性，降低细胞上清液中TNFα，IL6，MDA含量及LDH活性，提示葛根素抗AS机制之一可能是通过抑制ERK1/2信号通路，减轻PM25诱导的氧化应激损伤及炎症反应，从而保护血管内皮细胞，这一发现有望为葛根素在AS防治中的应用提供新的理论依据。

[参考文献]

[1] Vanhoutte P M. Endothelial dysfunction： the first step toward coronary arteriosclerosis[J]. Circ J， 2009， 73（4）：595.

[2] Kalsch H， Hennig F， Moebus S， et al. Are air pollution and traffic noise independently associated with atherosclerosis： the heinz nixdorf recall study[J]. Eur Heart J， 2014， 35（13）：853.

[3] Painschab M S， DavilaRoman V G， Gilman R H， et al. Chronic exposure to biomass fuel is associated with increased carotid artery intimamedia thickness and a higher prevalence of atherosclerotic plaque[J]. Heart， 2013， 99（14）：984.

[4] 魏述永. 葛根素心血管保护作用及其机制研究进展[J]. 中国中药杂志， 2015， 40（12）：2278.

[5] Davel A P， Lemos M， Pastro L M， et al. Endothelial dysfunction in the pulmonary artery induced by concentrated fine particulate matter exposure is associated with local but not systemic inflammation[J]. Toxicology， 2012， 295（1/3）：39.

[6] Chen Y Y， Chen J， Zhou X M， et al. Puerarin protects human umbilical vein endothelial cells against high glucoseinduced apoptosis by upregulating heme oxygenase1 and inhibiting calpain activation[J]. Fundam Clin Pharmacol， 2012， 26（3）：322.

[7] Zhang L， Ji Q， Liu X， et al. Norcantharidin inhibits tumor angiogenesis via blocking VEGFR2/MEK/ERK signaling pathways[J]. Cancer Sci， 2013， 104（5）：604.

[8] Rao X， Zhong J， Maiseyeu A， et al. CD36dependent 7ketocholesterol accumulation in macrophages mediates progression of atherosclerosis in response to chronic air pollution exposure[J]. Circ Res， 2014， 115（9）：770.

[9] Wan Q， Cui X， Shao J， et al. Beijing ambient particle exposure accelerates atherosclerosis in ApoE knockout mice by upregulating visfatin expression[J]. Cell Stress Chaperones， 2014， 19（5）：715.

[10] Ahearn J， Shields K J， Liu C C， et al. Cardiovascular disease biomarkers across autoimmune diseases[J]. Clin Immunol， 2015， 161（1）：59.

[11] Besbes S， Mirshahi M， Pocard M， et al. New dimension in therapeutic targeting of BCL2 family proteins[J]. Oncotarget， 2015， 6（15）：12862.

[12] 孙龙飞， 安冬青. 炎性信号通路在动脉粥样硬化中的机制与中医药干预作用研究进展[J]. 中国动脉硬化杂志， 2015， 23（11）：1177.

[13] Chen Y Y， Chen J， Zhou X M， et al. Puerarin protects human umbilical vein endothelial cells against high glucoseinduced apoptosis by upregulating heme oxygenase1 and inhibiting calpain activation[J]. Fundam Clin Pharmacol， 2012， 26（3）：322.

[14] Yang X， Hu W， Zhang Q， et al. Puerarin inhibits Creactive protein expression via suppression of nuclear factor kappaB activation in lipopolysaccharideinduced peripheral blood mononuclear cells of patients with stable angina pectoris[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol， 2010， 107（2）：637.

[15] Bao L， Zhang Y， Wei G， et al. The antiatherosclerotic effects of puerarin on inducedatherosclerosis in rabbits[J]. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub， 2015， 159（1）：53.