虎眼万年青提取物对肝纤维化的治疗作用研究

[摘要] 采用四氯化碳（CCl4）制备小鼠肝纤维化模型，检测AST，ALT，γGT，MDA，GSHpx，SOD等血清指标，ELISA方法检测PCⅢ，IVC，LN，HA等血清标记物；肝组织采用HE和Masson胶原染色，光镜下观察病理学改变；Western blot检测Ⅲ型胶原、TGFβ，αSMA，Ecadherin蛋白表达，观察虎眼万年青提取物对CCl4诱导的小鼠肝纤维化治疗作用，并探讨作用机制。结果表明，虎眼万年青提取物组（50，150，500 mg・kg-1）均可明显降低血清AST，ALT，γGT，MDA水平，升高GSHpx，SOD水平；降低肝纤维化血清标志物 PCⅢ，IVC，LN，HA的表达；明显改善CCl4所致大鼠肝纤维化的病理学改变，证明虎眼万年青提取物对肝纤维化具有治疗作用。其机制是可能与抑制细胞外基质沉积，抑制肝星形细胞活化以及抑制上皮间质转化，进而抑制肝脏纤维化有关。

[关键词] 虎眼万年青； 肝纤维化

Research ontherapeutics effect of extract of Ornithogalum caudatum on liver fibrosis

GAO Lu1， ZHANG Ming2， SU Ting1， QU Jiale1， JIANG Wenyue3*

（1Jilin Modern Chinese Medicine Engineering and Research Center Co， Ltd，

Changchun 130012， China；

2School of Basic Medical Science， Jilin University， Changchun 130000， China；

3Changchun Kang Bida Technology Co， Ltd， Changchun 130012， China）

[Abstracr] Rat models of liver fibrosis were made by carbon tetrachloride， and the serum levels of AST， ALT， γGT， MDA， GSHpx， SOD were detected， serum markers of PCⅢ， IVC， LN， HA were detected by ELISA method HE and Masson staining were conducted in hepatic tissues to observe pathological variations Collagen Ⅲ， TGFβ， αSMA， Ecadherin were detected by Western blot The curative effect of the extract of Ornithogalum caudatum on rat liver fibrosis induced by CCl4was observed and the mechanism was discussed The experiment results showed that the extract of O caudatum （50， 150， 500 mg・kg-1） obviously decreased the serum levels of AST， ALT， γGT， MDA， increased the serum levels of GSHpx， SOD， decreased the expression of serum markers of PCⅢ， IVC， LN， HA， and improved the liver pathological variations of fibrotic rats The experiment proved that the extract of O caudatum could treat the liver fibrogenesis induced by CCl4 in rats The positive medicine may inhibit accumulation of extracellular and activate hepatic stellate cell and epithelialmesenchymal transition

[Key words] Ornithogalum caudatum； liver fibrosis

doi：10.4268/cjcmm20161222

肝纤维化是当今医学研究领域的热点难点之一，肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的共同病理学基础[1]，虽然肝硬化的病理改变具有不可逆性，但近来大量的临床和实验室研究表明肝纤维是一个相对可逆的病理过程[2]。因此，阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化和慢性肝病具有重要意义，寻找抗肝纤维化药物是治疗慢性肝病的当务之急。

虎眼万年青Ornithogalum caudatum Ait又名珍珠草、胡连万年青，为百合科多年生草本植物，含有皂苷、多糖、黄酮、萜类、生物碱、挥发油及微量元素等成分[3]。民间用其鲜汁液涂抹患处以治疗疗疮，内服可治疗无名肿毒、肝炎、肝硬化、肝癌等，均具有很好的治疗效果，在我国各地广泛栽培，资源丰富，是一个非常有开发价值的药用植物[45]。现代药理研究发现虎眼万年青皂苷类成分具有很强的抗癌活性，虎眼万年青多糖还能有效地增强小鼠非特异性免疫和体液免疫功能[68]，但相对于肝脏疾病的治疗作用研究报道较少。

本研究通过四氯化碳（CCl4）制备小鼠肝纤维化模型，观察虎眼万年青提取物H30对肝纤维化的治疗作用，并初步探讨虎眼万年青提取物H30对肝纤维化的作用机制，为开发虎眼万年青抗肝纤维化作用药物提供理论依据。

1 材料

11 动物 清洁级ICR小鼠，雄性，体重20～22 g，由吉林大学实验动物中心提供，质量许可证号SCXK（吉）20070003。

12 药品与试剂 虎眼万年青乙醇提取物由吉林修正药业新药开发有限公司提供（批号20140625）；ALT，AST，超氧化物歧化酶（SOD），脂质过氧化物（MDA），γGT，谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx） 试剂盒（货号分别为C0091，C0101，A0011，A0031，C0172，A005）购自南京建成生物工程研究所，ELISA试剂盒购自R&D公司；蛋白裂解液（货号P0013B）及蛋白定量（货号P0012S）试剂盒购自碧云天生物技术研究所；抗体购自Santa Cruz公司；一般化学试剂购自Sigma公司及北京化工厂。

2 方法

21 肝纤维化模型制备 造模6周：造模组每周2次腹腔注射10% CCl4植物油溶液（25 mL・kg-1），同时给予10%乙醇溶液；正常组给予饮用水，每周2次腹腔注射等体积植物油。

22 分组与给药 肝纤维化造模小鼠按体重随机分为正常组、模型组、H30低剂量组（50 mg・kg-1）、H30中剂量组（150 mg・kg-1）、H30高剂量组（500 mg・kg-1）和水飞蓟宾组，每组15只。为防止肝组织的自我修复，模型组、H30低、中、高剂量组和水飞蓟宾组每周腹腔注射1次20% CCl4植物油溶液（25 mL・kg-1），其正常组腹腔注射等体积植物油。给药4周后，眼球取血，离心，血清-20 ℃保存；取肝脏，-80 ℃保存。

23 血清测定 血清肝功指标及氧化指标检测按照各个试剂盒说明书指定的方法进行测定。ALT，AST试剂盒采用赖氏法，超氧化物歧化酶（SOD）采用氧化羟胺法，脂质过氧化物（MDA）、γGT采用酶法，谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）采用还原酶法。

ELISA方法检测纤维化相关指标[9]。空白对照孔：只加显色剂A，B和终止液；标准品孔：加入标准品50 μL，链霉素HRP 50 μL（标准品中已含有抗体）；样品孔：加入样品40 μL、抗体10 μL、链霉亲和素HRP 50 μL。37 ℃温育60 min，弃去液体，每孔分别加满洗涤液洗涤5次后弃去，拍干。每孔加显色剂A 50 μL，显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色10 min。加终止液50 μL，终止反应，以空白孔调零，450 nm波长下测定吸光度（A）。根据标准品的浓度及对应的A绘制标准曲线，利用标准曲线计算样品浓度。

24 肝组织蛋白的提取及电泳样品的制备 取-80 ℃冷冻的肝组织样品50 mg，置于研钵内，加入适量液氮迅速研磨。将研碎的组织随液氮倒入 1 mL 蛋白裂解缓冲液中，冰水浴下匀浆机匀浆，每次10 s，每个样品匀浆 3 次，匀浆液 4 ℃放置60 min，之后4 ℃ 3 000 r・min-1离心 15 min，再以13 000 r・min-1离心 15 min，收集上清，即蛋白原液。按照 BCA 试剂盒说明书操作测定蛋白原液中蛋白浓度。取适量蛋白原液，4×loading buffer调蛋白浓度至 8 g・L-1，混匀后，沸水水浴 5 min，冷却后备用，也可于-20 ℃冰箱保存。

25 Western blot法 按常规电泳制胶过程制备凝胶。以每孔10 μL（8 g・L-1）蛋白量上样，Marker 加样孔中加入 4 μL的蛋白预染 Marker 液。设定初始电压80 V，约30 min后，当样品处于浓缩胶与分离胶交界处时更换电压至 160 V，待目的蛋白相对分子质量两侧的预染 Marker 条带分离充分之后，停止电泳。依次通过转膜、封闭[10]处理后用 TBST 洗 3 次，放入用 TBST 稀释好的一抗中，4 ℃孵育过夜，次日取出 PVDF 膜用 TBST 洗 3 次，放入用TBST 适当稀释的二抗中，室温孵育 2 h，取出上述加二抗处理的 PVDF 膜，用TBST 洗 4 次，后用ECL 试剂盒显色，上海天能凝胶成像系统显示。蛋白条带利用 Quantity One 软件进行分析，结果以目的蛋白与 GAPDH 的A比值表示。

26 统计学分析 采用SPSS 120进行数据统计学分析，数据以±s表示；多组样本均数的比较采用单因素方差分析；方差齐各组间实验数据的比较采用LSDt检验；方差不齐各组间实验数据的比较采用DunnettT检验。P

3 结果

31 虎眼万年青提取物H30对肝纤维化小鼠血清标记物的影响 肝纤维化病理基础为细胞外基质（ECM ）过度增多和异常沉积，研究显示层粘连蛋白（LN）异构体、Ⅲ型胶原前体（PCⅢ）、透明质酸酶（HA）、Ⅵ型胶原与ECM的形成具有平行关系，临床亦常用此指标作为评价肝纤维化的诊断标准。

本研究对这上述4项指标检测，结果表明，与正常组相比，模型组小鼠血清中LN异构体，PCⅢ，HA，VI型胶原表达显著增加，表明肝纤维化模型制备成功；H30治疗后，不同程度降低这4个指标血清中水平（图1）。这一结果提示，虎眼万年青提取物H30可抑制肝纤维化血清学标志物的表达，具有治疗肝纤维化的作用。

32 虎眼万年青提取物H30对肝纤维化小鼠肝组织病理形态学的影响 大体观察及染色结果显示，模型组呈现出纤维化肝组织病理特征：肝脏增大，呈黄红色，包膜紧张，质较软，HE及Masson 染色见肝小叶结构紊乱，伴有较多炎性细胞浸润，汇管区扩大，纤维组织明显增生，有纤维间隔形成，并延伸分割肝小叶；H30治疗组肝脏多成暗红色，质软，HE及Masson 染色可见肝小叶结构较紊乱，肝细胞炎性浸润程度明显减轻，坏死灶减少，中央静脉周围及汇管区纤维组织轻度增生，有纤维间隔形成[11]（图2，3）。

33 虎眼万年青提取物H30对肝纤维化小鼠肝功指标的影响 肝功检测结果显示，模型组与正常组相比，ALT，AST，γGT等肝功指标明显升高，表明肝纤维化小鼠肝脏功能减弱；H30提取物50，500 mg・kg-1剂量组与模型组相比，ALT，AST，γGT水平均显著下调，表明H30对肝脏功能具有明显改善作用（表1）。

34 虎眼万年青提取物H30对肝纤维化小鼠抗氧化指标的影响 已有研究证实，肝纤维化发生时清除氧自由基相关酶活性下降，氧自由基生成增加。本研究结果表明，GSHpx及SOD在模型组均明

显降低，而MDA明显升高，提示肝纤维化时机体清除氧自由基能力下降，这一趋势与酒精性脂肪肝一致；H30提取物各剂量组均明显升高GSHPx及SOD水平，降低MDA水平，该结果提示H30可通过提高机体氧自由基清除能力发挥治疗肝纤维化的作用（表2）。

35 虎眼万年青提取物H30对肝脏纤维化发病机制关键蛋白表达的影响 肝纤维化发病机制复杂，多个信号通路参与。ECM过度增多和异常沉积是肝纤维化发病的关键因素，ECM主要包括转化生长因子β （TGFβ）以及肝组织Ⅲ型胶原；肝星形细胞激活是肝纤维化治疗的重要靶点，而作为标记蛋白的α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，αSMA）能够反应肝星形细胞激活的状态；上皮间质转化（EMT）过程是纤维化发生发展重要的参与者，贯穿于纤维化过程的的发生发展，EMT最突出的特征是上皮组织细胞的一些标志物质（如Ecadherin）的丢失[12]，同时获得了间质细胞的某些特征（如αSMA的表达增强等）。

本研究观察肝纤维化小鼠肝组织中这4个关键蛋白的表达，结果表明，肝纤维化小鼠肝组织中Ⅲ型胶原及TGFβ表达均明显增加，提示肝纤维化发生时，细胞外基质沉积增加，沉积与降解平衡紊乱（图4）；αSMA表达亦明显增加，提示肝星形细胞可能处于激活状态，是肝纤维化发生的重要起始因素；Ecadherin表达明显降低，提示肝脏组织有上皮间质转化的发生（图5）。虎眼万年青提取物H30高、中、低剂量治疗后，均明显改善关键蛋白的异常，表现为Ⅲ型胶原及TGFβ表达降低，αSMA表达降低而Ecadherin表达增加，同时阳性药水飞蓟宾具有类似的作用，提示虎眼万年青提取物治疗肝纤维化通过多靶点发挥作用，其抗肝纤维化作用可能与细胞外基质沉积，肝星形细胞增殖以及上皮间质转化均有关。

4 结论

本研究主要观察了虎眼万年青乙醇提取物H30对肝纤维化的治疗作用，结果表明虎眼万年青乙醇提取物可改善肝纤维化小鼠肝脏功能以及病理形态学，抑制氧自由基生成，提高清除氧自由基的能力，同时明显抑制肝纤维化血清学标记物的水平，提示虎眼万年青对肝纤维化的治疗作用。早在民间就有虎眼万年青用于肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的治疗作用，但尚无系统性研究报道虎眼万年青抗肝纤维化有效组分及作用机制。本研究在细胞及整体水平系统验证了虎眼万年青亲水性组分治疗肝纤维的作用，并针对肝纤维化发病机制的多通路、多靶点特点，初步探讨虎眼万年青乙醇提取物治疗肝纤维化的作用机制，研究结果再次证明了中药治疗肝纤维化这种具有复杂发病机制类疾病的优势。本研究首次揭示了虎眼万年青提取物治疗肝纤维化的机制可

能由多个通路参与，主要包括与细胞外基质沉积相关的通路，肝星形细胞活化通路以及上皮间质转化通路，但其发挥抗肝纤维化的作用机制通路尚有待进一步完善。

综上，本研究阐明了虎眼万年青乙醇提取物具有治疗肝纤维的作用，其作用机制与肝纤维化发病中的多条机制通路有关，研究结果为虎眼万年青乙醇提取物作为抗肝纤维化药物的开发提供理论依据。

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