大鼠牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞分化成骨样细胞能力对比研究

[摘要]目的：以骨髓间充质干细胞作为参考，讨论牙髓干细胞作为骨组织修复种子细胞的可行性。方法：通过酶消化法获得大鼠牙髓干细胞，离心法获得骨髓间充质干细胞，贴壁培养，通过倒置光学显微镜观察二者形态差异；流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞的间质细胞表面标志物表达；ＭＭＴ法检测细胞生长曲线；特定的成骨诱导液诱导干细胞成骨分化，免疫荧光法检测成骨细胞表面标志物表达。结果：分离的大鼠骨髓间充质干细胞与牙髓干细胞形态学以及生长特性具有相似性，且符合间充质干细胞特性，牙髓干细胞第4天进入对数生长期，第7天进入平台期，骨髓间充质干细胞第4天进入对数生长期，第8天进入平台期；经过成骨诱导后二者都具备成骨样细胞分化能力，牙髓干细胞在成骨诱导后的骨钙素表达上与骨髓间充质细胞有着相似的能力；牙本质泌涎蛋白表达阳性。结论：牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞都具有成骨分化能力，但牙髓干细胞细胞成分相对复杂，增殖能力较强。

[关键词]牙髓干细胞；培养；诱导；成骨样细胞

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）04-0597-03

Comparative study on the capacity of rat dental pulp stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells in differentiating to osteoblast-like cells

ZHAI Xu,CAO Rui,CAI Lei,WU Jing-guo,SUN Xue-jian,LV Chang-sheng

(Research Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College,Beijing 100144,China)

AbstractObjectiveTo research the capacity of dental pulp stem cells which was induced to osteoblast-like cells , by comparing bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Pulps and bone marrow were isolated from 6-weeks rats,then pulps was been digested by collagenase I. morphology difference was distinguished by optical microscope. FCM(flow cytometry) was uesd for identifying the purity of BMSCs. Drawing growth curves for cells was chooen. Cells was introduced by osteogenetic induced flow. OCN and DSP were targeted in immunofluorescence test, as being oseteo-markers.ResultsCells isolated from rats tissues were corresponded to the mesenchymal cell. Cells proliferated faster at the fourth day after cultivation.Both of the tow cells have the capacity of differentiating to osteoblast-like cells though inducing cultivation. OCN and DSP were detected on both cells.ConclusionDPSCs had the same capacity to differentiate to osteoblast-like cells with BMSCs,and got a more ability of proliferation.

Key words:dental pulp stem cells;cultivation;inducing;osteoblast-like cells

骨组织缺损修复研究是近年来研究较多的热门学科，越来越多的研究者着眼于通过干细胞分化修复骨缺损类相关疾病，并获得了初步的进展。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是目前人们研究较多的一类多能干细胞，通过诱导可以分化为成骨样细胞[1]。2000年Gronthos[2]等发现牙髓干细胞(DPSCs)，为干细胞研究提供了一类新的种子细胞。研究表明DPSCs在分化潜能上具有多能干细胞的特点，经诱导可以向脂肪，神经等方向分化[3-4]。啮齿类动物的一生中牙齿会不断的磨损与消耗，新生的组织又会不断的对其进行修复[5]，由此可见DPS Cs具有较强的成骨分化能力。本实验通过诱导大鼠BMSCs与DPSCs向成骨细胞分化，并对其进行相关技术检测，将二者进行比较，为骨组织缺损修复种子细胞的研究提供一定的依据与技术方法。

1材料

1.1 实验动物：SD大鼠（6周龄）由北京协和医学院整形外科医院提供。

1.2 试剂：DMEM培养基（Hyclone），胎牛血清（Gibco），双抗，I型胶原酶，胰酶(Sigma)，噻唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO），地塞米松，抗坏血清，β-甘油磷酸钠（Sigma），抗大鼠CD90单抗IgG，抗大鼠CD45单抗IgG（eBioscience,USA）,抗大鼠osteocalcin单抗，抗大鼠DSP单抗（SANTA CRUZ ,USA）,FITC标记山羊抗兔IgG(康为世纪，北京)。

2方法

2.1 取材与细胞培养：将6周龄SD大鼠断颈处死，75%酒精浸泡消毒。无菌条件下，切开取出股骨与胫骨；剪断股骨胫骨干骺端，2ml注射器吸取PBS反复冲洗骨髓腔以及干骺端，洗出液1 000rpm离心6min。反复消毒口腔后，分离下颌骨，无菌条件下分离大鼠下颌切牙牙髓组织，PBS反复冲洗三次，1%的I型胶原酶37℃消化1.5h后800rpm离心6min。分别将上述两种离心液弃上清，加入含10%FBS,1%双抗的DMEM培养基重悬，经200目滤网过滤，CO2温箱培养，原代次日换液，以后每间隔一天换液一次。待细胞80%～90%融合后胰酶消化传代培养。

2.2 MTT检测：分别取BMSCs和DPSCs的P2代细胞以每孔5 000个的密度接种至96孔板，待大部分细胞贴壁后加入5mg/ml的MTT液20μl，温育4 h后小心吸出液体，加入150μlDMSO,温育10min后吸出在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。每日测量，连续10天标记个点绘制生长曲线。

2.3 流式细胞仪检测：分别取二者P2代细胞，细胞计数后稀释至10 000/ml，以1ml/管加入EP管，编号后分别加入100μl CD45,CD90抗体以及相关同型对照，4℃作用1h，10 000rpm离心2min去上清，加入PBS清洗，离心去上清，反复清洗三次后经流式细胞仪检查表面CD45，CD90表达。

2.4 成骨分化诱导：将P2代BMSCs和DPSCs分别接种至六孔板，加入含10%FBS,10nm/L地塞米松，50μg/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的成骨诱导培养基进行诱导培养。两周后细胞爬片进行免疫荧光染色，观察经诱导后细胞OCN与DSP的表达情况。

3结果

3.1 光镜下观察：光镜下可见大鼠BMSCs呈梭形生长，核圆位于细胞中间，形态狭长的细胞彼此连接，胞浆透亮，可见散在成集落生长的细胞群（见图1A）。DPSCs光镜下形态呈多角形，细胞成簇生长，内部紧密处细胞较多，且排列较为集中，形态已多边形为主，边缘处细胞生长较为稀疏，细胞形态狭长类梭形，胞质丰富，细胞核圆，居中（见图1B）。

3.2 细胞生长曲线：P1代细胞传代后经过1天培养大部分细胞贴壁，换液后将无法贴壁的细胞清除，以后隔日换液一次，每日分别测量96板中3孔的吸光值取平均值，连续检测10天。通过吸光值的变化绘制生长曲线。可见，加入的细胞在前3天变化相对较小，在第4天进入生长的对数期，生长随度增快，并在第7天左右进入生长平台期（见图2），DPSCs的增殖分裂的速度相对BMSCs相比更为旺盛，并且通过光镜观察在96孔底部牙髓干细胞排列更为紧密。

3.3流式细胞表面标志物检测：通过流式细胞标志物检测发现，经过传代培养，接受检测的P2代BMSCs细胞形态大小相对集中，由造血干细胞表面表达的标志物CD45为阴性，阳性率82.9%（见图3）。

3.4 成骨分化：P2代DPSCs与BMSCs经矿化液诱导约两周后，分别进行OCN和DSP免疫荧光染色，可见经诱导DPSCs表达OCN阳性（见图4B），DSP阳性(见图4D);BMSCs表达OCN阳性(见图4A)，DSP阴性（见图4C）。培养四周后DPSCs茜素红染色可见钙化结节（见图5）。

4讨论

全骨髓贴壁法培养骨髓干细胞，虽然不能从免疫学角度最大化的区分骨髓中细胞的复杂性，但通过贴别，传代的进行，P2代细胞的流式细胞技术检测可以发现所培养的骨髓干细胞细胞大小较集中,表面标志物显示特异性表达CD45分子的造血干细胞基本消失，得到相对较纯的间充质细胞的同时尽可能减少了免疫学分选给细胞带来的损伤。DPSCs作为来源于牙髓组织的间质干细胞定位于牙髓内微血管周围[6]其周围细胞外基质主要是I型胶原和III型胶原可被I型胶原酶消化分解,通过形态学和细胞培养的观察消化过程不会影响细胞活性以及分化能力。

BMSCs在原代培养的前两天可见大量的血细胞悬浮，经过换液可将悬浮的红细胞，白细胞等清除，传代后细胞充分生长，可见成梭状贴壁生长的细胞。DPSCs则相对贴壁较快，可见呈长梭形，多角形细胞分布，在细胞间连接建立后生长进入对数期，增殖增快，其形态与BMSCs相比体积略小，形态也更近似多角形。 Bleicher等[7]研究发现牙髓根部与尖部的DPSCs牙本质细胞在修复牙本质过程中OCN表达具有差异性。流式细胞学检测中可以发现DPSCs的散点图表现为前，侧向散射光跨度较大，这表明接受检测的P2代细胞在形态大小上较为分散，细胞内胞质所含颗粒情况也相对差异较大[8]，相比较BMSCs则表现的相对均一集中。

OCN是成骨细胞合成的一种非特异性蛋白，其与骨的钙化以及钙的运输有关，同时其能够抑制羟基磷灰石异常结晶的形成的功能在成骨过程中起到关键的作用[9]。在体外试验中OCN可作为成熟成骨细胞的标志随着成骨细胞分化的增加表达增多[10]。通过免疫荧光染色发现，在本试验中经过两周诱导，DP SCs的OCN表达与BMSCs相比，在阳性率以及表达强度上相似。DSP作为成牙本质细胞分化过程中表达的蛋白，在成牙本质过程中起到重要作用[11]，经过诱导两周后的检测，DPSCs的DSP表达阳性，表明其在矿化诱导过程中与BMSCs也存在着一定差异，前者分化的成骨样细胞更倾向于成牙本质细胞。成骨诱导培养四周，进行茜素红染色可见细小的钙结节沉积于培养基底部，进而进一步证实了DPSCs的成骨能力。

随着组织缺损与修复的研究投入增加，干细胞移植成为修复缺损性疾病，以及再造组织的重要治疗手段，从种子细胞，培养诱导方法，检测手段等各个方面都得到了飞速发展。其中对于骨髓间充质干细胞的研究尤为深入[12-13]。因此以骨髓间充质干细胞作为对比，研究牙髓干细胞在成骨诱导液诱导下的分化能力具有较高的参考价值。本实验相关研究表明，大鼠牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的成骨能力，细胞增殖，克隆形成能力也较强，可在诱导后两周接种待成骨部位，适合作为骨组织缺损修复的种子细胞。

[参考文献]

[1]Derubeis AR,Cancedda R. Bone marrow stromal cells in bone engineering:limitations and recent advances[J]. Ann Biomed Eng,2004,32(1):160-164.

[2]Gronthos S,Mankani M,Brahim J,et al. Postnatal human dental pulp stem cell(DPSC) in vitro and in vivo [J].Proc Nail Acad Sci USA,2000,97(25):13625-13630.

[3]Gronthos S,Brahim J,Li W,et al.Stem cell properties of human dental pulp stem cells[J]. J Dent Res,2002,81(8):531-535.

[4]郭延红,吕晶,柯杰,等.大鼠牙髓干细胞可塑性研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2008,18(11):601-606.

[5]Ohshima H,Nakasone N,Hashinoto E,et al. The eternal tooth germ is formed at the apical end of continuously growing teeth[J].Arch Oral Biol,2005, 50(2):153-157.

[6]Shi S，Gronthos S.Perivascular niche for postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp[J].Bone Miner Res,2003,18:696-704.

[7]Bleicher F,Couble ML,Farges JC,et al.Sequential ex-expression of matrix protein genes in developing rat teeth [J] . Matrix Biol,1999,18(2):133-143.

[8]李嘉言,车绪春,张锡宝.流式细胞仪在医学研究与检验工作中的应用[J].广东医学,2004,25(1):96-98.

[9]李恩,薛延,王洪复,等.骨质疏松鉴别诊断与治疗[M].北京：人民卫生出版社，2005：10-34.

[10]Beris AE,Lykis sas MG ,Papageorgiou CD,et al. Advances in articular cartilage repair[J].Injury,2005,(36 Suppl 4):S14-23.

[11]Moses KD, Butler WT, Qin C. Immunohistochemical study of small integrin-binding ligand, N-linked glycoproteins in reactionary dentin of rat molars at different ages[J].Eur J Oral Sci,2006,114(3):216-222.

[12]Collin P,Nefussi JR, Wetterwald A. et al. Expression of collagen,osteocalcin and bone alkaline phosphatase in a mineralizing rat osteoblastic cell culture[J]. Calcif Tissue Int,1992,50(2):175-183.

[13]Wang X,Hisha H,Taketani S,et al.Characterization of mesenchymal stem cells isolated from mouse fetal bone marrow[J].Stem Cells,2006,24(3):482.

[收稿日期]2010-11-25[修回日期]2011-02-26