暴死的埃及塘虱病原菌的鉴定

革胡子鲶( Clarias gariepinus) 俗称埃及塘虱， 上世纪80 年代从埃及引入我国［1］。该鱼肉质细嫩，具有生长速度快，耐低氧，适合高密度养殖等特点，已成为我国多个省市淡水养殖的重要品种。近年来在革胡子鲶的养殖中，疾病发生有逐年增多的趋势。对革胡子鲶疾病的研究，国外已经报道的病原有细菌及寄生虫［2-5］，其中嗜水气单胞菌( Aero-monas hydrophila) 曾导致东南亚国家养殖革胡子鲶暴发溃疡性流行性疾病，给当地养殖业造成了严重的经济损失［6］。但是国内对革胡子鲶疾病研究尚未引起足够的重视，对养殖中所发生的疾病种类、病因、病原的研究报道尚缺乏，导致养殖生产中对疾病防治缺少依据。2009 年及 2010 年的 11 月间，山东潍坊某养殖场养殖的革胡子鲶成鱼进入越冬池后，发生急性出血性败血症，并导致暴发性死亡。该病传染性强、致死率高，给养殖生产带来极大的损失。为查明发病原因，本课题组对发病鱼进行了病因分析及病原的排查，对分离的可疑性病原进行了毒力验证及分类鉴定，并对分离菌株进行了药物敏感性分析，为该病防治提供理论依据。

1 材料和方法

1. 1 材料

患病革胡子鲶取自山东省潍坊市某淡水鱼养殖场，体长 35 ～40 cm，均具有典型发病症状。人工感染用健康革胡子鲶由潍坊某革胡子鲶育苗场提供，平均体长 15 cm。攻毒前暂养于水族箱中，水温为 23 ～24 ℃，养殖实验用水为曝气 48 h 后的自来水，暂养 7 d 适应环境后供感染实验用。

1. 2 病症检查

取具典型发病症状的革胡子鲶，检查鱼体形态、皮肤、鳍、鳃丝等部位出现的异常变化，取少量异常组织做水浸片镜检; 解剖鱼体，检查其内脏器官，并切取少量组织做水浸片镜检，记录各异常症状。

1. 3 病原菌的分离纯化

取濒死病鱼，用酒精棉球对鱼体体表和腹部消毒后，用无菌注射器抽取病鱼腹水，于 LB 平板划线分离; 随后无菌解剖病鱼，剪取鳃、肝、肾、脾和腹部出血部位小块组织于无菌离心管中，参照范文辉等［7］的方法于 LB 平板上作细菌分离。将分离后细菌平板置于28 ℃恒温培养20 h 后， －80 ℃冰箱保存备用。

1. 4 病原菌形态观察

分离细菌划线接种于 LB 平板上，28 ℃ 培养18 h 后，按常规方法进行革兰氏染色和氧化酶试验［8］，培养 24 h 后观察菌落形态。

1. 5 人工感染实验及细菌毒力分析

实验菌在 LB 培养基上 28 ℃纯化分离 3 次后，无菌生理盐水洗下菌落，稀释为 2 × 108、2 × 107、2 × 106和 2 × 105CFU / mL 菌悬液。腹腔注射感染健康革胡子鲶鱼( 0. 1 mL/尾) ，每组 10 尾，对照组注射等量生理盐水，每组设 2 个平行。感染后实验鱼置于水体 25 L 水箱养殖，水温 23 ～24 ℃，每天投饵及换水吸污一次，养殖观察14 d，记录死亡鱼数，对死亡鱼进行解剖和病原菌再分离( 方法同1. 3) 。实验结束后用 Reed ＆ Muench 方法［9］计算半致死剂量( LD50) 。

1. 6 病原菌的鉴定

对目标菌株分别采用细菌全细胞脂肪酸鉴定系统( MIDI 公司，美国) 、Biolog 微生物自动鉴定系统( Biolog 公司，美国) 及细菌 16 S rDNA 序列分析3 种方法进行鉴定。细菌全细胞脂肪酸提取参照宋红梅等［10］方法，应用 Sherlock Microbial Identifica-tion System 软件( MIDI 公司，美国) 鉴定菌株。Bi-olog 细菌鉴定按 Biolog 系统操作手册 4. 2 版进行，简要过程为: 细菌接种到鉴定板后 30 ℃培养，分别于 5 h 和 20 h 用 Biolog 读数仪读数，用 BiologGENⅢ MicroStation 软件鉴定菌株。细菌 16 S rDNA序列扩增按范文辉等［7］的方法，PCR 产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果经BLAST 分析后，用 Clustalx 1. 83 软件与 GenBank中相关菌株进行同源性比对，采用 Mega4 软件进行系统进化树建立、统计和聚类分析。

1. 7 细菌药物敏感检测

采用 KB 纸片扩散法: 取 LB 平板28 ℃培养20h 菌落，无菌生理盐水制成 1 × 108CFU / mL 菌悬液，每平板加 0. 1 mL 涂布 LB 平板，贴放药敏纸片，28 ℃培养 20 h 后测定抑菌圈直径。敏感度根据杭州微生物试剂有限公司提供的标准进行判定。

2 结果

2. 1 病症

鱼塘中发病革胡子鲶浮于水面，游动缓慢，病鱼下颌及鳍基部发红溃烂，严重者有血流出，腹部及体侧有点状充血，红肿外凸，腹部膨大( 图1) 。解剖后可见病鱼肝脏呈土黄色; 脾脏、肾脏明显肿大，失去原有弹性，组织易破碎; 肠壁充血，腹腔内有大量含血的腹水，颜色暗红，粘稠度低( 图 2) 。对鳃丝、溃烂皮肤、肝脏、脾脏、肾脏及肠道镜检，没有发现寄生虫。

2. 2 病原菌结果分离

从患病革胡子鲶肝、肾及腹腔积水中分离到优势度在 80%以上病原菌一株，分离株在 LB 培养基菌落为圆形、边缘整齐光滑、中央凸起，灰白色，有光泽，直径约 1. 5 mm。菌体革兰氏染色为阴性，短 杆 状， 氧 化 酶 反 应 阳 性。 该 菌 株 编 号2010111403( 简称 1403)。

2. 3 可疑病原菌的毒力评价

菌株 1403 悬液腹腔注射革胡子鲶，高浓度组( 2. 0 ×108CFU / mL) 在 24 h 左右开始死亡，症状为下颌及腹部体表有出血点，解剖可见脾肿大，肾暗红，腹腔内有少量带血腹水。中浓度组( 2. 0 ×107CFU / mL 与 2. 0 × 106CFU / mL) 感染的革胡子鲶在 48 h 后开始出现发病症状，体表发红，病鱼活力减弱，浮于水面，至第 8 天时实验组革胡子鲶的死亡数趋于稳定，对照组无一例死亡。攻毒 2 周后死亡结果见表 1。由表 1 可见: 菌株以 2. 0 × 107CFU /mL 注射革胡子鲶的死亡率为 10% ，2. 0 × 108CFU / mL 的死亡率达 90% 。回归感染发病革胡子鲶主要症状与自然发病革胡子鲶病症相似，根据感染实验结果判断，分离菌株 1403 为引起本次革胡子鲶暴发急性出血性败血症的主要致病病原。按Reed ＆ Muench 法计算得菌株 1403 对革胡子鲶LD50为 6. 32 ×106CFU。

2. 4 病原菌的鉴定结果

2. 4. 1 脂肪酸鉴定

菌株 1403 全细胞脂肪酸的气相色谱分析表明( 图 3) ，共得到 18 种不同脂肪酸成分，占优势的脂肪酸成分为 12: 0( 4. 22%) 、14: 0( 4. 44%) 、16: 0 ( 21. 82% ) 、18: 0 ( 2. 50% ) 、 Sum In Fea-ture2 ( 6. 44% ) 、Sum In Feature3 ( 36. 84% ) 、SumIn Feature8( 17. 18% ) 。其余脂肪酸成分的含量介于 0. 12% ～1. 17%之间。所得数据与 MIDI 数据库( TSBA6 6. 10) 比对，结果显示菌株 1403 与嗜水气单胞菌( A. hydrophila) 的相似度为 0. 826，初步鉴定 1403 为 A. hydrophila。相似性指数( Similarity In-dex) 大于 0. 500 时表明匹配性高，为典型的菌种。

2. 4. 2 Biolog 鉴定

应用 Biolog-GN 微生物自动鉴定系统，分析了菌株对 95 种碳源的利用情况，反应结果显示菌株1403 可利用糊精、淀粉等 37 种碳源，不能利用环糊精、N-乙酰基-D 半乳糖胺等 53 种碳源( 表 2) 。软件分析结果表明，菌株 1403 为嗜水气单胞菌( A. hydrophila) 的可能性为 74%，最高相似率为0. 641，相似率大于 0. 5，结果可信，由此判定细菌菌株 1403 为 A. hydrophila。

2. 4. 3 16 S rDNA 序列比对和系统发育分析

菌株 1403 PCR 扩增后得到 1. 5 kb 大小片段，与预期目标相符。将扩增产物测序结果在 GenBank中进行同源序列检索，经过同源性比较，发现菌株1403 与嗜水气单胞菌的 16 S rDNA 序列同源性达到 99%。根据菌株 1403 的 16 S rDNA 基因序列与相关属种 16 S rDNA 基因序列构建系统发育树( 见图 4 ) 。 可 见 菌 株 1403 与 嗜 水 气 单 胞 菌( A. hydrophila( AB473034. 1 和 AB473039. 1) ) 聚合，说明菌株 1403 与嗜水气单胞菌亲缘关系最近，可判定为 A. hydrophila。

2. 5 病原菌的耐药性分析

对 16 种药物的敏感性试验揭示( 表 3) ，菌株1403 对菌必治、庆大霉素、四环素等 9 种高度敏感; 对卡那霉素、多粘菌素 B 等 3 种中度敏感;而对链霉素、克林霉素、罗红霉素等 4 种耐药。

3 小结

革胡子鲶是热带鱼类，不耐低温，北方地区利用塑料温棚及地下热水提高养殖水体温度技术解决了革胡子鲶越冬问题，并实现种苗的自给［11］，因此该鱼已在北方多个省份形成较大产业规模。近年来革胡子鲶越冬养殖中，疾病发生呈逐年增多趋势，但国内对革胡子鲶疾病研究报道几近空白，病原种类不详，仅见少量疾病治疗方法的经验介绍。本研究从山东潍坊地区患出血性败血症的革胡子鲶体内分离出一株可疑病原菌 1403，回归感染实验表明其对革胡子鲶具较强致病性，通过 3 种方法均鉴定菌株 1403 为嗜水气单胞菌。嗜水气单胞菌属弧菌科气单胞菌属，广泛分布于自然界各水体，是人畜鱼共患病原［12-13］。嗜水气单胞菌对淡水鱼类有很强致病性，可感染日本鳗鲡( Anguilla japonica) 、黄鳝( Monopterus albus) 、鲟鱼( Acipenser baerii) 等多种鱼类［14-16］，且疾病分布范围广泛。本研究结果显示，潍坊地区越冬革胡子鲶所暴发出血性败血症也主要为嗜水气单胞菌感染引起。嗜水气单胞菌在很多时候是一种条件致病菌，越冬养殖的革胡子鲶疾病暴发可能与养殖环境因素变化有关。革胡子鲶耐低温能力差，越冬期养殖池水温度低，养殖密度高，水质差，且越冬革胡子鲶经历了室外养殖池到越冬池的搬运，一定程度上导致鱼体受伤，上述因素可能是革胡子鲶感染嗜水气单胞菌并发生严重疾病的诱因。细菌耐药性分析发现，嗜水气单胞菌菌株1403 对复方新诺明、链霉素、克林霉素等 4 种抗生素具有耐药性，对庆大霉素、四环素、先锋霉素等 9 种抗生素高度敏感，同时对卡那霉素、多粘菌素 B 及利福平中度敏感。调查表明该地区养殖革胡子鲶并未投喂相应的药物，菌株 1403 耐药性可能源于耐药基因不同来源细菌间的传递［17］。类似耐药传递在集约化养殖中已有相关证据，如直接用家畜肥料进行鱼塘肥水时，家畜体内耐药性细菌可导致养殖鱼塘中细菌的耐药［18］。