喜炎平注射液对老鼠肺泡灌洗液的作用

本文作者：聂颖兰 范 斌 闫 寒 唐春山 彭 娟 郭 娜 赵小亮 崔海峰 冯淑仪 杨小玲 李志勇 于友华 单位：中国中医科学院医学实验中心 江西青峰药业有限公司

喜炎平注射液的成分为水溶性穿心莲总内酯磺化物，是从中药穿心莲中提取精制而成的总内酯结晶，临床上广泛用于治疗急性上呼吸道感染、小儿病毒性肺炎及小儿支气管肺炎，有较好的疗效［1］。余洋等对喜炎平注射液进行了体内抗菌试验、解热试验、抗炎试验及止咳试验研究。结果表明，喜炎平对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌感染小鼠有明显的保护作用，有明显的解热、抗炎作用，对枸橼酸致豚鼠咳嗽次数有明显抑制作用［2］，并为临床用药提供了信息［3］。王潞等［4］检测了喜炎平注射液的体外细胞毒性以及对多种炎性细胞因子如NO、TNF-α、及IL-6的抑制作用，表明喜炎平注射液能显著抑制LPS诱导的RAW264．7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α等炎性因子，且喜炎平体外对前炎症因子的抑制作用强于穿琥宁注射液，推测喜炎平注射液可能是通过调节巨噬细胞产生NO、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子从而发挥抗炎作用。本研究通过检测细菌内毒素(LPS)所致急性肺损伤(ALI)大鼠发病过程中给药喜炎平注射液治疗前后多种细胞因子的变化，以探讨喜炎平注射液治疗内毒素性肺损伤的机制。

1材料与方法

1.1材料LPS(Escherichiacoli0111:B4)购自美国Sigma公司，TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-4、IL-6和IL-10等试剂盒均为RB公司产品，喜炎平注射液购自江西青峰药业有限公司(批号20090613)。全自动多功能酶标仪:MULTISKANMK3，Thermo，USA;电热恒温培养箱:DH4000A，天津泰斯特;漩涡振荡器(MINIshaker):MH-1，kylin-BellLabInstrumentsQILINBEIER。

1.2动物及分组健康雄性SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，体重150g±10g，适应性饲养3d，实验前禁食过夜，自由饮水。随机分成7组，正常对照组(NS组，n=9):尾静脉注射生理盐水0.2ml，注射后30min尾静脉注射生理盐水8ml•kg－1。模型组(LPS组，n=27)，尾静脉注射LPS2mg•kg－1，注射30min后尾静脉注射生理盐水8ml•kg－1。给药组(XYP组，n=27):尾静脉注射LPS2mg•kg－1，注射后30min尾静脉注射喜炎平注射液200mg•kg－1(喜炎平注射液规格50mg•2ml－1，给药量8ml•kg－1)。NS组于LPS注射2h后取材，LPS组与XYP组分别于LPS注射2h、4h、6h后取材，每组9只。

1.3支气管肺泡灌洗液(BALF)麻醉后固定大鼠，暴露气管，进行插管，以1.5ml生理盐水灌洗全肺，收集灌洗液，重复3次。将BALF离心(3500rpm，离心10min)收集上清液，置－80℃冰箱冻存待测。1.4测定方法采用ELISA法，各细胞因子严格按照试剂盒操作说明书操作。

1.5结果处理以均数±标准差(x珋±s)表示。采用SPSS16.0统计学软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)，各组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

表1显示，与NS组相比，2h时LPS组大鼠BALF中IL-1β，TNF-α显著升高(P＜0.05)并达到高峰，而后逐渐下降。与同时间点LPS组相比，2h时XYP组大鼠BALF中IL-1β含量显著性降低，4h、6h时XYP组逐渐降低至正常水平，各时间点TNF-α含量均降低，但较LPS组无显著性差异。与NS组相比，2h、4h时LPS组大鼠BALF中IL-6、IL-8逐渐升高，6h时达到高点(P＜0.01)。6h时XYP组大鼠BALF中IL-6含量较LPS组显著性降低。与NS组相比，LPS组大鼠BALF中IL-10、IL-4含量显著升高，2h即达高峰(P＜0.05);2h时XYP组较LPS组含量下降，其他时间点无显著性差异。

3讨论

内毒素脂多糖一旦侵入机体可促使巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等释放大量的细胞因子，损害组织细胞。LPS攻击肺部时，可以造成肺泡毛细血管膜的损害，导致多形核中性粒细胞的附着、激活与积压，同时影响气体交换并最终导致呼吸衰竭［5］。同时，LPS可以使机体产生大量炎性介质，目前认为参与急性肺损伤(ALI)的炎症因子超过40种，其中最重要的也是研究最多的是促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等)和抗炎症介质(IL-4、IL-10等)，本研究对大鼠BALF中上述细胞因子进行测定［6］。本研究发现，尾静脉注射LPS后，大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-4、IL-10含量均明显升高，可以认为LPS诱导了急性肺损伤的炎性反应，各细胞因子均参与了急性肺损伤的病理变化过程。LPS作用2h时BALF中TNF-α和IL-1β的含量明显高于NS组，6h有所下降但仍高于NS组。这与以往的报道一致，即TNF-α和IL-1β属于早期触发型细胞因子，LPS静脉或腹腔注射后2h～4h分泌达到高峰［7］。TNF-α和IL-1β是主要的快速反应促炎介质［8］。TNF-α对肺有强烈的毒性作用，能引起白细胞迁移，损伤血管内皮细胞造成毛细血管渗漏，引起ALI;还可刺激其他细胞因子的生物合成［9～11］。IL-1β能促进骨髓释放中性粒细胞，在炎症局部释放溶酶体酶和其他细胞因子，还能引起粒细胞脱颗粒释放炎症介质，进一步导致细胞损害。二者协同作用，增加血管内皮通透性，加重肺损伤，使黏附分子在细胞表面的表达增加，使中性粒细胞从血管渗出到肺泡腔并进一步释放更多的TNF-α和IL-1β［12］。给药喜炎平注射液后，各时间点TNF-α和IL-1β的含量均较LPS组降低，逐渐降至正常水平，2h时IL-1β的含量显著性降低(P＜0.05)，喜炎平注射液可有效抑制TNF-α和IL-1β的释放。TNF-α和IL-1β可诱生IL-6［6］和IL-8等细胞因子［13］。IL-6能作用于肝细胞诱导急性期蛋白的合成，而IL-8可作为急性炎症期的标志物，是中性粒细胞有力的趋化因子和激活因子，在感染和其他刺激期间对中性粒细胞浸润至肺部起重要作用［14］。与NS组相比，LPS组大鼠BALF中IL-6和IL-8含量均逐渐升高，6h时达到高峰。各时间点给药后IL-6和IL-8含量较LPS组降低，6h时显著降低，约至正常水平，说明喜炎平注射液可以直接或间接抑制促炎因子IL-6和IL-8的释放从而发生抗炎作用。IL-10和IL-4是机体重要的一个抗炎因子，在内毒素型肺损伤的动物模型中，其含量升高，可抑制某些促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等)的产生，防止机体发生继发性的组织损伤［15］。但另一方面可造成机体免疫功能的下降，导致对感染的易感性增加［6］。注射LPS后IL-10和IL-4显著升高，2h达高峰，表明机体能及时产生IL-10和IL-4等抗炎因子，抑制促炎因子的产生，减少机体损伤。但给药喜炎平注射液后，IL-10和IL-4等含量降低约至正常水平，使促炎因子/抗炎因子趋向平衡，抑制急性肺损伤病程中出现的过度抗炎反应。

4结论

给药喜炎平注射液后，各细胞因子水平均较模型组降低，推测喜炎平注射液可通过抑制促炎因子的释放发挥抗炎作用，并可使促炎因子/抗炎因子趋向平衡，抑制急性肺损伤病程中出现的过度的抗炎反应。