达乌尔黄鼠门齿及骨骼生长层特征

摘要：研究达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus，又称草原黄鼠，蒙古黄鼠，豆鼠）在冬眠期间和非冬眠期间门齿生长速度的变化及骨骼生长层的特征。并由骨骼生长层特征判断达乌尔黄鼠的年龄与门齿磨损程度之间的关系。

关键词：达乌尔黄鼠 冬眠 门齿 骨骼生长层

1 引言

1.1 国内外研究

由于达乌尔黄鼠门齿无齿根，能终生生长，所以必须磨损，以求得生长平衡。两个相对的门齿如不能相遇在一起，对它会导致严重的后果。众所周知，达乌尔黄鼠属于冬眠型动物，那么在冬眠时达乌尔黄鼠门齿生长速度的变化以及门齿不断生长所留下的齿痕就是研究的方向。并由齿痕可判断达乌尔黄鼠年龄。

2 标本收集

1.取材

取达乌尔黄鼠门齿制作石蜡切片标本，收集黄鼠，取黄鼠上门齿。门齿取下后，由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。

2.固定

将黄鼠门齿取下后，迅速放入固定剂中，固定的目的是尽快使固定液渗入门齿内部，将门齿内组织固定，以保持其原有的结构。固定剂会使门齿适当硬化以便于随后的处理。应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。

3.冲洗

固定后的黄鼠门齿在进行必须用流水洗去固定液。黄鼠门齿应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。

4.脱钙

将切下的门齿部分浸泡于AFAA液加38%盐酸（体积比为20：1）的固定脱钙液中，每两天换一次新液，共计8天。脱钙终点的判定标准是按照传统的针刺试验法和草酸钠化学实验法相结合的方法，每6小时用细针刺入组织，考察组织柔软性。当针刺感觉阻力不大时，说明组织基本上脱钙完全，化学实验法检测钙质是否完全溶解，取5mL脱钙液用适量NaOH调整至中性，再加5%草酸钠1mL，5分钟后脱钙液清凉表示脱钙液中不含有钙质。若液体浑浊。则表示有钙质，应继续脱钙直至液体清亮。

5.透明

将黄鼠门齿放入透明剂中，常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使门齿变脆的透明剂，因此透明的时间宜短，一般在20分钟即可。透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中1小时左右，然后取出放入纯二甲苯中20分钟即可。

6.浸渗

在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为45～50℃之间，硬蜡熔点为56～58℃之间，60～62℃的硬蜡很少用。冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡。浸渗应在自动恒温箱中进行。浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后再通过各种方法使这种物质凝固，而将组织材料包埋其中。

7.透蜡和包埋

将黄鼠门齿放在石蜡中，约6～8小时，包埋用的石蜡，熔点在50～60℃之间，当门齿切片薄用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46～48℃的石蜡，夏季可选56～58℃的。

8.切片

（1）石蜡块的固着与整修

在包埋以后，对门齿进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。

固着：利用旋转式切片机上附有的可固着石蜡块的金属小盘，也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。

整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。

（2）切片方法

切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将包埋后的黄鼠门齿固定在标本台上，使包埋后的黄鼠门齿外切面与标本夹截面平行，并让包埋后的黄鼠门齿稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与黄鼠门齿切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。

9.展片和粘片

切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片，即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同，一般的56～58℃的石蜡切片℃的温水进行展片，48～52℃的石蜡切片用35℃的温水进行展片。等到蜡片充分展平后，取一清洁载玻片，载玻片上涂一薄层蛋白甘油，然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正，放到格盘内，置38℃温箱中烘干，然后即可进行染色。

10.染色

普通的染色法有两种即苏木紫伊红染色法（简写为HE）染色结果是细胞核为紫色，细胞质为粉红色；另一种方法为铁苏木紫染色（简写为IA），染色的结果是全部着以深浅不同的蓝色。

苏木紫伊红染色法整个染色过程如下：取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右，这个过程称为脱蜡。脱完蜡后的切片即可进行染色。

3 结果

可观察到黄鼠门齿切片明显分层，有磨损现象，鼠体年龄越大，其门齿磨损约严重。冬眠时的黄鼠门齿切片与正常时期的切片磨损程度相比较小。

4 结论

根据实验结果证明达乌尔黄鼠冬眠时门齿是在持续生长的，只不过门齿生长的速度变慢，由制作的切片可观察到门齿骨骼生长层特征，随着鼠体年龄的加大其磨损程度不断加重，露出的齿质面不断加大。本着使各年龄组所代表的绝对年龄时间尽量相等的原则，由此可以判断出达乌尔黄鼠的年龄。

参考文献：

[1]卢浩泉，李玉春. 以臼齿磨损程度划分大仓鼠年龄组的研究. 1991，18（2）：62-64

[2]董代辉，唐安科.鱼类透明标本的骨骼标本的研究.2000，10（2）：70-72