延胡索及L―THP对吗啡条件性位置偏爱大鼠奖赏环路多巴胺系统的影响及比较

[摘要] 目的：研究延胡索及左旋延胡索乙素（L-THP）对吗啡条件性位置偏爱（CPP）模型大鼠奖赏环路各脑区多巴胺递质与D2受体的影响及比较。方法：吗啡剂量递增颈背部皮下注射CPP训练10 d（起始剂量10 mg・kg-1，每天递增10 mg・kg-1，至注射10 d时为100 mg・kg-1），末次训练后48 h CPP检测确认模型建立成功，即日（12 d）延胡索水提液2，1，0.5 g・kg-1（分别含L-THP 0.153，0.077，0.038 mg），以及L-THP 3.76，1.88，0.94 mg・kg-1灌胃治疗，共6 d，第18天再次CPP检测，次日取材用高效液相法测定其中脑腹侧被盖区-伏核-前额叶皮质（VTA-NAc-PFC）奖赏神经环路各脑区多巴胺递质含量，免疫组化和Western blotting检测D2受体的表达。结果：与生理盐水治疗组比较，延胡索2，1 g・kg-1，以及L-THP 3.76，1.88 mg・kg-1组大鼠在白箱（吗啡伴药箱）停留时间明显减少（P

[关键词] 延胡索；L-THP；多巴胺；D2受体；VTA-NAc-PFC神经环路；精神依赖

[收稿日期] 2013-05-30

[基金项目] 国家自然科学基金项目（30860373）

[通信作者] 罗素元，Tel：（0852）8609552，E-mail：

药物成瘾是一种慢性复发性脑病[1]，就目前对于阿片类药物成瘾的治疗，难点在于怎样有效遏制急性脱毒后的高复吸（半年内复吸率90%以上[2]）。心瘾，即精神依赖是高复吸最主要的原因，而阿片类作用于中脑腹侧被盖（VTA）、伏核（NAc）和前额叶皮质（PFC）及其递质联系形成的脑奖赏环路（VTA-NAc-PFC神经环路）所引起的奖赏效应是精神依赖形成和维持的重要条件，多巴胺系统在其中发挥着重要作用[3]。前期研究结果已发现延胡索及其单体L-THP抑制吗啡CPP行为效应的途径之一是通过调控奖赏环路中的谷氨酸递质及其受体NR2B实现的[4-5]，然而，延胡索及其单体抑制吗啡CPP行为效应是否还通过多巴胺系统发挥作用则尚不清楚。本研究通过观察延胡索和L-THP对大鼠吗啡CPP效应消退作用，以及对VTA-NAc-PFc神经环路各脑区多巴胺递质含量和多巴胺D2 受体表达的影响，及其比较探讨二者抗吗啡精神依赖的中枢多巴胺能药理作用机制，为其阿片类精神依赖治疗的临床应用提供新的实验依据；并通过观察其作用的相似性与一致性程度，为延胡索的现代应用增加新的内容。

1 材料

1.1 动物 8周龄雄性SD大鼠（Sprague-Dawleyrats，SD），体重120～140 g，购于第三军医大学实验动物中心，合格证号SCXK（渝）2007-0005，实验前在动物房适应性饲养1周。实验室通风良好，室温24 ℃，光照周期8：00至20：00，大鼠自由进食饮水。

1.2 试剂及药品 盐酸吗啡注射液（沈阳第一制药厂，批号TD2006-0028）。D2受体免疫组化一抗（美国Santa Cruz公司），二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。D2受体Western blot一抗（美国Millipore公司），二抗（北京博奥森公司）。延胡索水提液的制备：取醋制延胡索中药饮片500 g，加水1 800 mL，浸泡70 min 后先用大火煮开，再用文火煎煮40 min，将药液冷至室温，过滤后得水提液500 mL（ 即1 g延胡索得1 mL水提液），经高效液相色谱法测定，1 mL水提液含L-THP 的量为0.076 5 mg，实验时用蒸馏水分别稀释成含延胡索0.2，0.1，0.05 g・mL-1的溶液；L-THP（左旋延胡索乙素，又名罗通定）对照品（中国食品药品检定研究院，批号100452-200301）；L-THP实验品（经高效液相色谱法测得其纯度>94%），购于广西中医药研究所。试验时用蒸馏水及少量稀HCl分别配置成0.376，0.188，0.094 g・L-1的溶液。

1.3 仪器 条件性位置偏爱箱根据文献制作[6]（60 cm×30 cm×30 cm），中间有可抽取的隔板间隔成为大小相同的2个箱，一箱为底部白色光滑，另一为底部黑色粗糙箱，抽取隔板时，实验大鼠可以自由穿梭其中；条件性位置偏爱视频跟踪-计算机自动分析系统（上海吉量软件科技有限公司）；LeicaQwin细胞图像分析系统（德国莱卡公司）；680型酶标仪（BIO-Rad， Japan）；美国Agilent 1100高效液相色谱仪；汉邦Lichrospher C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

2 方法

2.1 动物分组及建立吗啡CPP模型 将适量大鼠放置黑白箱中任其自由穿梭，15 min/次，每天1次，第3天分别记录大鼠在黑、白箱中停留的时间，剔除对黑或白箱有明显偏爱的大鼠，并确定黑箱为天然偏爱侧，选白箱为伴药箱。将合格的198只SD大鼠，按随机数字表法分为9组，每组22只，即生理盐水对照组（NS组）、吗啡CPP组（模型组）、生理盐水治疗组（NS治疗组）、延胡索高、中、低剂量组、L-THP高、中、低剂量组。除生理盐水对照组外，其他各组大鼠吗啡剂量递增颈背部皮下注射，每天上午注射吗啡，起始剂量为10 mg・kg-1 ，逐日递增，至第10天为100 mg・kg-1，注射后20 min置白箱训练40 min，连续10 d；下午注射生理盐水，注射后20 min置黑箱同法训练。NS组除给予等量NS代替吗啡外，其余方法皆同上。各组大鼠在末次吗啡训练48 h后，进行CPP测试。模型建立成功后，即刻处死NS对照组和模型组大鼠，参照脑立体定位图谱[7]分别取其VTA，NAc和PFC脑组织，高效液相色谱法检测（10只）多巴胺递质含量；免疫组化（6只）和Western blot（6只）检测D2受体的表达。

2.2 药物治疗 吗啡CPP模型建立成功后，对模型各组大鼠给予药物灌胃治疗，延胡索高、中、低剂量组给予延胡索2，1，0.5 g・kg-1水提液，L-THP高、中、低剂量组给予L-THP 3.76，1.88，0.94 mg・kg-1溶液，灌胃体积均为10 mL・kg-1，NS治疗组给予等体积NS灌胃，每日1次，连续灌胃6 d。并于第6天灌胃治疗后再次CPP测试各组大鼠在白箱的停留时间。

2.3 高效液相检测递质 各组取10只大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，断头处死，开颅取脑，取VTA，NAc，PFC组织称重后置2 mL匀浆器中，加入300 μL含0.1 mol・L-1的HClO4和0.2 mmol・L-1的EDTA-2Na的混合溶液，匀浆，4 ℃ 12 000 r・min-1离心10 min，取50 μL上清液进样。

2.4 免疫组化检测D2受体 各组取6只大鼠麻醉，用多聚甲醛经心脏灌注固定后开颅取脑，再固定，常规脱水，包埋并连续冠状切片（厚4 μm）。每只大鼠参照《SD大鼠大脑立体定位图谱》取包含VTA，NAc，PFC的脑区切片6张（每间隔20 μm取1张），按照D2受体检测试剂盒说明操作后，采用ABC法进行染色，同时用磷酸盐缓冲液替代一抗做阴性对照。LcicaQwin细胞图像分析系统400倍镜下观察各脑区D2受体阳性免疫反应产物。相同条件下每张切片随机拍摄6个视野，拍摄部位亦参照《SD大鼠大脑立体定位图谱》。Image-Pro plus软件计算每张照片D2受体阳性免疫反应产物的平均吸光度。

2.5 Western blot检测D2受体 各组取6只大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，断头处死，开颅取脑，取VTA，NAc，PFC组织称重，将收集的样品置4 ℃预冷裂解缓冲液中匀浆，离心后取上清。用BCA 蛋白试剂盒检测蛋白。然后用10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质， 每孔蛋白加样量为28 μg。100V电泳约2 h，100 mA转膜1.5 h；5%脱脂奶封闭1 h后一抗孵育4 ℃过夜（一抗浓度为1∶1 500）；次日， 复温1 h后1×TBST 洗3次，每次5 min， 二抗孵育1 h（二抗浓度为1∶1 500）；再次1×TBST洗3次，每次5 min。内参β-actin操作步骤同上， 一抗浓度为1∶1 500， 二抗为1∶2 000；显影、定影。Genetools软件分析并测定吸光度。

2.6 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行实验数据分析，实验数据用±s表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对t 检验，以P

3 结果

3.1 吗啡训练前后和治疗后各组大鼠白箱停留时间 与训练前各组和造模后NS对照组比较，模型、延胡索与L-THP高、中、低剂量组大鼠在白箱中停留时间均明显延长（P

表1 各组大鼠实验各时间点在白箱的停留时间 （±s，n=22）

Table 1 Accumulative detention time for the rats spent in the drug-paired chamber of the test apparatus（±s，n=22）

3.2 各组大鼠VTA，NAc和PFC脑区内多巴胺含量 与NS对照组比较，模型组各脑区多巴胺含量明显增高；与NS治疗组和模型比较，延胡索与L-THP高、中剂量组的多巴胺含量显著降低（P

表2 各组大鼠VTA，NAc和PFC中多巴胺含量（±s，n=10）

Table 2 The contents of dopamine in VTA，NAc and PFC（±s，n=10）

3.3 各组大鼠VTA，NAc和PFC脑区内D2受体表达 免疫组织化学染色结果：在VTA，NAc和PFC部位均可见阳性反应产物，颜色呈棕黄色，主要集中在胞膜和胞浆位置。分析发现，模型组各脑区中D2受体的平均吸光度NS对照组显著减少（P

与NS对照组比较1）P

图1 各组大鼠VTA，NAc和PFC中D2受体平均吸光度（±s，n=6）

Fig.1 The average optical density（AOD） of D2R positive cells in VTA，NAc and PFC（±s，n=6）

Western blotting检测结果：应用Leica Qwin细胞图像分析系统分别对2组图片进行分析，模型组各脑区中D2受体的平均吸光度较NS对照组显著减少（P

图2 各组大鼠VTA，NAc和PFC中D2受体蛋白平均吸光度（±s，n=6）

Fig.2 The average optical density（AOD） of D2R protein in VTA，NAc and PFC（±s，n=6）

4 讨论

本实验结果显示，经过不同浓度的延胡索和L-THP治疗后，延胡索2，1 g・kg-1和L-THP 3.76，1.88 mg・kg-1组大鼠在白箱的停留时间较NS治疗组显著减少，说明延胡索和L-THP均可加速吗啡CPP效应的消退，即延胡索和L-THP均有抑制吗啡奖赏效应即精神依赖的作用（与前期研究结果一致），其中L-THP与文献报道结论一致[5]。同时，上述各组大鼠VTA-NAc-PFC奖赏神经环路各脑区内多巴胺递质含量降低、D2受体表达水平上调，接近NS对照组，提示：延胡索和L-THP通过下调奖赏环路中升高的多巴胺递质含量、以及上调D2受体的表达可能是加速大鼠吗啡CPP效应消退的又一药理作用机制。此外，实验还显示延胡索2，1 g・kg-1及L-THP 3.76，1.88 mg・kg-1组不仅对大鼠吗啡CPP效应的影响相同，并且同步出现VTA，NAc和PFC中升高的多巴胺含量和下调的D2受体表达被逆转的结果，这提示：含1倍量L-THP单体的延胡索中药不但在抑制吗啡CPP行为学方面相当于单独应用约24倍L-THP单体的效果，而且，在对奖赏环路VTA，NAc和PFC脑区中多巴胺递质和D2受体的药理作用机制方面也具有很大的相似性。

已有研究发现，持续给予成瘾类药物可以损伤多巴胺能神经突触的正常结构，导致DA释放增加并抑制多巴胺的重摄取加重精神依赖的形成[8]。从VTA至NAC，PFC的中脑边缘多巴胺能系统的改变，在阿片类药物依赖者的躯体和精神依赖中发挥着重要作用[9-11]。而延胡索中所含的原小檗碱类化学成分进入中枢后，可优先阻滞脑内DA受体最丰富的脑区的D2受体亚型，逆转DA神经元的“损伤”。因此推测本实验延胡索和L-THP能下调奖赏环路各脑区中升高多巴胺递质含量，上调D2受体的表达量，主要与它们能逆转DA神经元的损伤和对多巴胺受体的阻滞作用有关。进一步，通过阻滞脑奖赏环路中的D2受体亚型，可降低吗啡产生的欣，减轻吗啡的奖赏效应，从而导致CPP效应的消退[12]。此外，本实验还发现延胡索与L-THP在治疗吗啡精神依赖的行为学和多巴胺能系统药理作用机制方面均有很大的相似性，但其量效关系差异较大，主要是因为延胡索中药内存在L-THP的同类物，可协同对抗吗啡的精神依赖，如延胡索乙素的右旋体D-THP虽然不是DA受体阻滞剂，但却具有协同L-THP阻滞DRD2的作用[13]；DL-THP亦具有阻断DA受体、对抗DA能神经系统功能增强的作用等[14]。所以，L-THP和延胡索功效虽然类似，但由于L-THP缺乏成分间的协同效应，而延胡索的疗效较好是其有效成分相互影响共同作用的结果。

现阶段在对延胡索化学成分的研究中，多追求单体化合物的作用，而中药防治疾病的物质基础是成分之间相互协调、相互影响、共同作用，以达到整体治疗功效[15]。本研究揭示对VTA-NAc-PFC奖赏神经环路中多巴胺递质含量与D2受体的影响，是延胡索和L-THP抑制吗啡CPP效应的又一药理作用机制，这说明二者的作用靶点不是单一的，而且延胡索中可能有其他成分与L-THP协同作用，但具体是什么成分，有待于进一步研究。本研究为从以延胡索为主药的戒毒单、复方中开发出治疗阿片类精神依赖的药物提供了新的实验依据；同时，通过比较二者对其多巴胺能系统影响的相似性程度，也为延胡索中药的现代化研究补充了新的内容。

[参考文献]

[1] Hyman S E， Malenka R C.Addiction and the brain：the neurobiology of compulsion and its persistence[J].Nat Rev Neurosci，2001，2：695.

[2] 邓艳萍.防复吸药物的研究进展[J].中国药物依赖性杂志，2010， 19（5）： 329.

[3] Robinson T E.Neuroscience.Addicted rats[J].Science， 2004，305 （5686）：951.

[4] 郭萍， 钱刚， 凌锌， 等.吗啡精神依赖大鼠 VTA-NAc-PFC神经环路谷氨酸递质和NR2B表达的变化[J].中华神经医学杂志， 2011， 10（5）： 471.

[5] 罗素元，郭萍，钱刚，等.延胡索水提物及左旋延胡索乙素抗吗啡条件性位置偏爱效应机制研究和效果比较[J].中国中药杂志，2012，37（22）：3457.

[6] Randall C K， Kraemer P J， Bardo M T.Morphine-induced conditioned place preference in preweanling andrats[J].Pharmacol Biochem Behav， 1998， 60（1）： 217.

[7] 包新民， 舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京： 人民卫生出版社， 1991： 9.

[8] Lyness W H， Friedle N M， Moore K E.Destruction of dopaminergic nerve terminals in nucleus accumbens： effect on d-amphetamine self-administration[J].Pharmacol Biochem Behav，1979，11（5）：553.

[9] Mizoguchi H， Watanabe C， Osada S， et al.Lack of a rewarding effect and a locomotor-enhancing effect of the selective μ-opioid receptor agonist amidino-TAPA[J].Psychopharmacology， 2010， 212：215.

[10] Russo S J， Dietz D M， Dumitriu D， et al.The addicted synapse： mechanisms of synaptic and structural plasticity in nucleus accumbens[J].Trends Neurosci， 2010， 33： 267.

[11] Johnson P M， Kenny P J.Dopamine D2 receptors in addiction-like reward dysfunctions and compulsive eating in obese rats[J].Nat Neurosci， 2010， 13（5）： 635.

[12] 赵娜， 党永辉， 陈腾.左旋四氢巴马汀在治疗药物成瘾中的应用研究进展[J].中国药物依赖性杂志， 2011， 20（1）： 8.

[13] Jin G Z， Xu S X， Yu L P.Different effects of enantiomers of tetrahydropalmatine on dopaminergic system[J].Sci Sin B， 1986， 29： 1054.

[14] 葛晓群， 张洪泉， 周华珠.四氢原小檗碱同类物缓解吗啡戒断症状作用的实验研究[J].中国药物依赖性杂志， 1999， 8（3）： 182.

[15] 王红， 田明， 王淼， 等.延胡索现代药理及临床研究进展[J].中医药学报， 2010， 38（6）： 108.

Study on effects of Corydalis yanhusuo and L-THP on dopamine of

reward circuitry in conditioned place preference rats and comparison

YU Shou-yang， YANG Pei-run， QIAN Gang， WU Ming-song， BAI Wei-feng， TU Ping， LUO Su-yuan

（Research Room of Cytogiology and Genetics， Zunyi Medical College， Zunyi 563000， China）

[Abstract] Objective： To study and compare the effect of Corydalis yanhusuo and L-THP on dopamine neurotransmitter and D2 receptor of reward circuitry in various cerebral areas of conditioned place preference model rats and the comparison of their effects.Method： The CPP model was established by injectingin rats with increasing doses for 10 days.The initial dose of 10 mg・kg-1， and the final dose of 100 mg・kg-1， with 10 mg・kg-1increased each day.At 48 h after the final training， CPP was adopted to detect the successful establishment of the model.On the same day （12 d）， they were orally administered with 2， 1， 0.5 g・kg-1 C.yanhusuo （containing 0.153， 0.077 and 0.038 mg L-THP） and L-THP （3.76， 1.88， 0.94 mg・kg-1） for six days.On 18 d， CPP test was performed again.Next day， HPLC was adopted to determine the content of dopamine neurotransmitters of reward circuitry in VTA-NAc-PFC； Immunohistochemistry and Western blotting were adopted to detect the expression of D2 receptors.Result： Compared with the physiological saline treatment group， C.yanhusuo （2， 1 g・kg-1） and L-THP （3.76， 1.88 mg・kg-1） groups showed that rats stayed in a notably shorter period in white boxes （morphine-accompanied boxes） （P

[Key words] Corydalis yanhusuo； L-THP； neurotransmitter dopamine； D2 receptor； VTA-NAc-PFC neural circuit； psychological dependence

doi：10.4268/cjcmm20132226