肿瘤坏死因子和血小板源性生长因子在人膜增生性肾小球肾炎中的表达

[摘要] 目的：探讨肿瘤坏死因子(TNF-α )和血小板源性生长因子-β (PDGF-β)在人膜增生性肾小球肾炎中的表达及其在发病中的作用。方法：采用HE、PAS、PASM、电镜及免疫组织化学SABC染色法对20例人膜增生性肾小球肾炎和10例对照组肾组织进行观察，并经计算机医学图像分析系统进行分析。结果：电镜下，肾炎组肾小球毛细血管明显增厚，且厚薄不均，基底膜内可见电子致密物，脏层细胞足突呈节段性融合。免疫组织化学染色，TNF-α 阳性反应产物在肾小管上皮细胞呈阳性表达，与对照组相比差异有统计学意义（P

[关键词] 人膜增生性肾小球肾炎；肿瘤坏死因子；血小板源性生长因子；免疫组织化学

[中图分类号] R363.2 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）02（a）-023-03

The expression of TNF-αand PDGF-β in the proliferative glomerulonephritis

ZHANG Wei-dong, LIU Yu-qing, LI Hong-li, LI Yuan-yuan, HUANG Wen-bo

(Department of Pathology of Weifang Medical College, Weifang261042,China)

[Abstract] Objective:To study the protein expression of TNF-αand PDGF-β in the pathogenesis of the human proliferative glomerulonephritis. Methods:Histopathological analysis(HE,PAS,PASM),electromicroscope and immunohistochemistry were used to evaluate the change and expression of TNF-αand PDGF-β in the tissues of kidney. Results: The protein expression of TNF-αand PDGF-β in glumeruli and renal tubles were much higher than control group(P

[Key words] Proliferative glomerulonephritis;Platelet-derived growth factor-β(PDGF-β);Tumor necrosis Factor-α(TNF-α ); Immunohistochemistry

增生性肾小球肾炎（proliferative glomerulonephritis）是危害人类健康的慢性病、多发病，有多种病理类型。其中，膜增生性肾小球肾炎可发生于儿童和成人，预后较差。50%的病例在10年内出现肾功能衰竭。多种细胞因子在肾小球疾病的进展和病理损伤中起着重要作用，已知肾内固有细胞包括系膜细胞都能合成和分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α )，而TNF-α 能刺激系膜细胞增殖。国外有研究发现伴有细胞增殖的肾小球肾炎均有血小板源性生长因子(PDGF)表达的增高；肾间质疾病时血管内皮细胞产生PDGF增多。因此，肿瘤坏死因子和血小板源性生长因子在膜增生性肾炎的进展中可能起着重要的作用。本实验观察了肿瘤坏死因子(TNF-α )和血小板源性生长因子－β (PDGF-β)在人膜增生性肾小球肾炎时肾小球和肾小管的蛋白表达，探讨两种因子在该型肾炎发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本

筛选本室肾穿刺活检标本（HE及免疫荧光等诊断为膜增生性肾小球肾炎）20例。正常对照组10例取自猝死尸解无明显肾脏病变的肾组织。福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，分别行PAS、PASM组织染色及TNF-α 、PDGF-β免疫组织化学染色。另取2例新鲜肾穿标本，2.5%的戊二醛固定，常规透射电镜样品制备，Epon 812包埋，70 nm超薄切片，醋酸双氧轴-枸橼酸铅染色，H-7500投射电镜观察。

1.2 PAS、PASM组织化学染色

按常规操作进行染色。

1.3 TNF-α 、PDGF-β免疫组化染色

免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德公司（即用型），采用SABC法。其中阴性对照以PBS代替一抗。染色步骤：①切片脱蜡至水；② 3%甲醇过氧化氢20 min，蒸馏水洗3次；③微波抗原修复；④相同切片分成两组，Ⅰ组滴加鼠抗人TNF-α 一抗，Ⅱ组滴加兔抗PDGF-β一抗， 4℃过夜，PBS洗3次；⑤Ⅰ组滴加生物素化羊抗鼠IgG，Ⅱ组滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温1 h；PBS洗3次；⑥滴加SABC复合物，室温1 h；⑦DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片。

1.4 图像分析

采用CMIAS医学图像分析系统，系统定标，分别取对照组和肾炎组免疫组织化学染色切片，光镜200倍视野下，切片分别采取肾小球和肾小管，每张切片随机选3个肾小球，再随机选3个肾小管视野输入计算机，用鼠标画出肾小球和肾小管的轮廓，测其吸光度值，以均值计算每个标本的吸光度，最后以每组的均值进行比较。

1.5 统计学方法

采用primer软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 苏木精-伊红（HE）染色

光镜下HE染色见肾小球弥漫肿胀增大，细胞数目增多的同时基底膜明显增厚。增生的细胞主要为系膜细胞，有的混有少量内皮细胞和中性白细胞。部分晚期病例增生的系膜伴有系膜基质的增多。肾小管和肾间质的病变与肾小球损伤的程度一致，显示不同程度的肾小管变性、萎缩并有炎症细胞浸润。

2.2 组织化学染色

PAS染色显示肾小球毛细血管基底膜明显增厚，同时肾小球内细胞数目增多。PASM染色见肾小球毛细血管壁有双层的基底膜出现，即双轨征。免疫荧光显示：IgG 和C3 呈弥漫性粗颗粒状荧光，IgG +~++，C3 +~++。

2.3 电镜观察

肾小球毛细血管基底膜明显增厚，且厚薄不均，基底膜内可见电子致密物，脏层细胞足突呈节段性融合。

2.4 TNF-α 免疫组织化学染色

阳性反应物呈棕黄色颗粒，依颗粒多少及染色深浅判定阳性强度。阴性对照切片未见阳性反应。正常对照肾组织中肾近曲小管上皮细胞仅呈微弱阳性反应，肾小球呈阴性反应。膜增生性肾小球肾炎切片中阳性表达明显，阳性颗粒见于肾小管上皮细胞内和肾小球内，以肾近曲小管上皮细胞反应最明显，呈强阳性，与正常组相比有显著性差异（P0.05），远曲小管上皮细胞未见明显阳性反应。且阳性染色强度亦与HE、PAS染色显示的病变程度一致。两组间肾小球、肾小管TNF-α 表达比较见表1。

2.5 PDGF-β免疫组织化学染色

阴性对照切片未见阳性反应。正常对照组：肾小管及肾小球呈阴性反应。膜增生性肾小球肾炎切片中PDGF-β蛋白表达明显，阳性反应见于肾近曲小管上皮细胞，肾小球及肾远曲小管弱阳性；且阳性染色强度与HE、PAS、PASM染色显示的病变程度一致；两组间肾小球、肾小管PDGF-β蛋白表达比较见表2。

3 讨论

肿瘤坏死因子（TNF-α ）是单核巨噬细胞、淋巴细胞产生的参与机体炎症反应的重要因子。但其在肾炎发病中的具体作用尚未清楚。本实验显示在正常人肾小球内无TNF-α 阳性物质表达，而在膜增生性肾小球肾炎患者肾小球内出现TNF-α 阳性表达，阳性颗粒分布于系膜区，且阳性染色强度与系膜增生程度相关，可提示TNF-α 在膜增生性肾小球肾炎中表达升高，TNF-α 可刺激系膜细胞、中性粒细胞及血管内皮细胞合成炎症介质，进一步使肾小球毛细血管通透性升高，加重单核细胞及中性粒细胞浸润等，又使TNF合成和分泌增强，形成了细胞因子网络的相互作用。研究证实，IL-6、IL－8和TNF-α 是肾脏疾病重要的炎症介质,除直接作用于组织细胞外,也可诱发其他炎症介质的产生而间接发挥作用。TNF-α 是机体炎症和免疫反应的重要调节因子,肾脏内多种细胞如系膜细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞均可产生TNF-α ，它可刺激系膜细胞表达黏附分子、合成及分泌细胞因子、前列腺素、血管活性肽等,并刺激成纤维细胞增生，促进纤维化。这些细胞因子之间均有相互诱导、促进和刺激作用，通过促进肾小球系膜细胞增生、细胞外基质沉积、炎症细胞浸润等,最终使肾小球硬化、间质纤维化[1]。本实验的研究结果与朱辟疆等[2]发现的TNF-α 通过自分泌和旁分泌不仅刺激系膜细胞分裂增殖，还可以刺激系膜细胞分泌IL-1、IL-6等多种炎性细胞因子，加重系膜细胞的增殖的结果相似。此外，本实验发现肾小管上皮细胞TNF-α 表达在膜增生性肾小球肾炎中明显增强，提示此时的肾小管合成和分泌TNF-α 增强。有研究结果[3]显示，TNF-α 从全身和局部两方面发挥其生物学作用，肾小管上皮细胞TNF-α 表达与肾小管损伤正相关，肾组织内表达的TNF-α 与血中的水平及肾脏病理的轻重一致，进一步证实了局部TNF-α 的水平与肾脏损伤的程度及疾病的进展关系密切。TNF-α 在肾小球及肾小管上皮细胞内的同时高表达，提示其在肾小球系膜增生、肾间质纤维化等病变的发展中起了十分重要的作用。

一系列动物实验和人体尸体解剖证实PDGF在肾炎的发生中起了重要作用[4]。本研究显示PDGF蛋白在膜增生性肾小球肾炎中呈阳性表达，且与对照组相比，有统计学差异，提示PDGF蛋白表达升高与系膜细胞增生及系膜基质增多有关。研究显示[5]PDGF与肾小球系膜细胞关系密切，系膜细胞可分泌PDGF，而PDGF可促进系膜细胞增生，是其最强的有丝分裂原；PDGF还有使系膜细胞收缩、趋化、分泌细胞外基质等作用，并可促进系膜细胞分泌其他细胞因子。显示PDGF是肾小球局部反应的重要介质之一。蒋小云等[6]也证实PDGF在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、单核细胞和成纤维细胞中呈强阳性反应，尤其是系膜细胞PDGF的表达最强。何立群等[7]用RT-PCR方法证实PDGF在病变肾组织中广泛分布，提示它与肾小球、肾间质及肾小管病理改变均相关。PDGF作为细胞增殖的诱导剂可强烈刺激肾小球系膜细胞和内皮细胞增殖、巨噬细胞浸润、胶原蛋白积聚和基质沉积。本实验发现，PDGF蛋白在系膜增生性肾小球肾炎中的肾小管上皮细胞呈阳性表达，且与对照组相比，有统计学差异，与蒋小云、何立群等研究结果相符。提示PDGF在肾炎发病中不仅影响肾小球系膜细胞和系膜基质，同时也可能参与了肾小管损伤修复及再生的过程，从而通过间质纤维化促进肾硬化。

有学者发现，肾小球内系膜细胞可在血小板源性生长因子的刺激下产生肿瘤坏死因子[8]。两种细胞因子均在肾近曲小管表达，提示膜增生性肾小球肾炎时肾小管的改变不容忽视，尤其是功能活跃的肾脏近曲小管，其在肾间质纤维化中可能起到更为重要的作用。因此，重视肾炎时肾小管的损伤修复变化或许是控制肾间质纤维化的有效手段。两种细胞因子在膜增生性肾小球肾炎时同时表达，提示肾炎发病中存在多种因子相互间的网络作用。抗细胞因子的应用和阻断细胞因子的相互作用是临床治疗的新思路。

[参考文献]

[1]王汉民,李锋,刘亚玲,等,不同病理类型肾病综合征患者血清IL-6,IL-8及TNF-α 水平的变化[J].现代医学,2004,32(3):173-175.

[2]朱辟疆,解冰,江丽萍.肾炎康对系膜增生性肾炎大鼠肿瘤坏死因子-α 和内皮素-1的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2006,13(3):150-152.

[3]邹春波,杜玄一,解汝娟,等,莫索尼定及福辛普利钠对阿霉素肾病肾组织TNF-α 影响的对比研究[J].中国血液净化,2006,5(8):433-436.

[4]Ooi BS,Cohen DJ,Veis JH.Biology of the mesangial cell in glomerulonephritis-role of cytokines[J].Proc Soc Exp Biol Med,1996,213:230-237.

[5]柴华旗,陈孝文.血小板源性生长因子与各种疾病研究进展[J].国外医学泌尿系统分册,1999,19(2):72-76.

[6]蒋小云,陈述枚,莫樱,等.系膜增生性肾炎患儿肾组织血小板源性生长因子及其受体表达的临床研究[J].中国实用儿科杂志,2001,16(10):600-601.

[7]何立群,王怡,曹和欣,等.抗纤灵冲剂对慢性肾衰模型肾组织TNF-mRNA,PDGF-mRNA的影响[J].中国实验方剂学杂志,2003,9(5):29-32.

[8]宋晓英,张玲.细胞因子与系膜细胞[J].重庆医学,2003,32(6):696-697.

（收稿日期：2007-10-31）

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