正交设计法优化厚朴七物颗粒剂的提取工艺

摘 要：目的：采用正交设计优化厚朴七物颗粒剂的水提取工艺。方法：正交法考察加水倍数、煎煮时间、煎煮次数三因素对水提取工艺的影响。HPLC法对有效成分厚朴酚与和厚朴酚进行含量测定。结果：10倍加水量，1h的煎煮时间，煎煮2次为最佳提取工艺。HPLC法含量测定：厚朴酚与和厚朴酚回归方程分别为Y=6856 X-372.5，r=0.9999，线性范围1.057-6.342 μg、Y=6427 X+583.6，r=0.9999，线性范围0.728-4.368 μg。检查项中阴性对照、稳定性、精密性等试验均符合试验标准。结论：优化的提取工艺高效稳定。

关键词：厚朴七物颗粒剂；正交设计；高效液相色谱法

厚朴七物汤出自东汉医学名家张仲景的《金匮要略》 [1]。应用于胃肠炎、肠梗阻、肠痉挛、食积发热、发热腹痛、老年习惯性便秘等病症，疗效显著。目前，在临床上仍沿用其传统的汤剂剂型，尚无关于厚朴七物汤中药制剂的相关文献报道，给患者的使用带来极大不便。本课题采用正交试验考察了加水倍数、煎煮时间和煎煮次数对厚朴七物颗粒剂提取工艺的影响，为“厚朴七物汤”的颗粒制剂在临床上更广泛的应用提供理论支持。

1.材料与方法

1.1 仪器

十万分之一电子天平（BP211D型） Sartorius ； Waters 600高效液相色谱系统（美国） ；Waters2996二极管阵列检测器 ；Waters717plus 自动进样器（含48位及96位进样盘）；超声波清洗仪（SB3200型）上海Branson ； C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）大连伊力特 。

1.2试剂与药材

厚朴酚对照品与和厚朴酚对照品（购于中国药品生物制品检定所）、甲醇（色谱纯）、超纯水、甲苯一甲醇（17：1）。本课题中使用的厚朴、枳实、桂枝、大黄、甘草等中药材均购于哈尔滨北京同仁堂分店。

2. 方法与结果

2.1含量测定方法建立

2.1.1溶液的配制

对照品溶液制备：精密称取厚朴酚与和厚朴酚的对照品4.228 mg、2.9142 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇适量溶解后稀释至刻度，充分摇匀即得1 mL含厚朴酚0.4228 mg与和厚朴酚0.2914 mg的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取恒重干燥提取物3.000 g，置于锥形瓶中加甲醇25 mL，称重，密塞后超声处理30 min，冷却后加甲醇至原始重量，摇匀后滤过即得。

阴性样品溶液的制备：处方中除去厚朴后的各种药材，采用与供试品同样的制备工艺，制备出不含有厚朴的阴性样品溶液。

2.1.2色谱条件[2]

C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇-水（78：22），流速1.0 mL/min，检测波长294nm，柱温25 ℃，进样量5 μL。

2.1.3标准曲线的绘制

精密量取含厚朴酚与和厚朴酚的对照品混合液2.5 μL、5.0 μL、7.5 μL、10 μL、12.5 μL、15 μL。依次注入高效液相色谱仪中，对每次样品进行检测，求出峰面积并对结果进项线性分析，考察其线性关系。求得回归方程：厚朴酚，Y=6856 C-372.5，r=0.9999，线性范围1.057-6.342 μg；和厚朴酚Y=6427 C+583.6，r=0.9999，线性范围0.728-4.368 μg。

2.1.4精密度试验

取上述含有厚朴酚与和厚朴酚的混合对照品溶液5 μL，重复进样6次，对峰面积A进行偏差分析。得厚朴酚的峰面积 RSD 为1.04 %，和厚朴酚的峰面积 RSD为1.07 %。 说明仪器精密度良好。

2.1.5稳定性试验

取配制好的供试品溶液，密封后在室温保存，考察时间分别为0，12，24，36，48，60h的含量，对实验结果进行偏差分析。结果显示，RSD值为0.5401 % ，表明此含量测定方法的稳定性良好，60h之内可以保证样品稳定。

2.1.6回收率试验

取供试品溶液6份（其厚朴酚浓度为0.844 mg/mL）。并配置厚朴酚对照品浓度同样为0.844 mg/mL的溶液，精密量取上述两种溶液各2.5 μL，加入50 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，分别进样并分析所测量结果。显示，本方法加样回收率为99.5 %，且RSD值为1.034 %，在偏差允许范围内，准确性较高。

2.2提取工艺的考察

2.2.1处方的确定

原处方根据汉代度量衡与现代单位之间的换算之后，厚朴七物汤处方为：厚朴24 g，甘草9 g，大黄9 g，大枣20 g，枳实5 g，桂枝6 g，生姜15 g。

2.2.2提取方法与因素水平的确定

按处方称取9份，分别浸泡40 min后，按正交设计进行煎煮，并分别将煎煮液过滤后浓缩至相对密度为1.08-1.15 （80 ℃），放冷至40 ℃时加入乙醇至含醇量为75 %，冷藏24 h后过滤，滤液回收乙醇后真空干燥至恒重。通过测定厚朴酚和和厚朴酚的含量筛选出最佳工艺，具体方法见表。

2.2.3 正交试验结果

按照正交试验方案的设计，对处方中厚朴的有效成份厚朴酚和和厚朴酚的提取结果进行分析，结果见表二由表二可见，影响提取液中有效成分厚朴酚和和厚朴酚浓度的因素是C（煎煮次数）>B（煎煮时间）>A（加水倍数），即煎煮次数的影响最大。方差分析的结果显示煎煮次数对工艺影响的差异具有显著意义，而煎煮时间和加水倍数对工艺的影响没有显著差异。所以，最终确定的提取工艺为A2B2C2 。

2.2.4验证试验

根据正交试验所确定的结果，对提取工艺的A2B2C2提取条件进行三次重复性试验，以验证该提取条件的稳定性。结果三次试验的结果无显著性差异，RSD为1.425 %。

3 结果

本方是张仲景对厚朴三物汤和桂枝去芍药汤的合方。桂枝去芍药汤减轻了厚朴三物汤对胃黏膜的损害，同时在促进肠推进方面，也对厚朴三物汤产生了“相使”的作用，加强了后者的肠推进作用[3-4]。临床上厚朴七物汤常用于治疗胃肠型感冒、肠梗阻、急性肠炎、痢疾初起等表里同病的疾病[5-7]。仲景以厚朴命其名，且厚朴用量独重（半斤），乃知其为方中君药。厚朴的主要有效成分是厚朴酚与和厚朴酚，作为本实验的考察指标采用正交试验设计优化了厚朴七物颗粒剂的提取工艺，最终确定了加水10倍，煎煮时间1h，煎煮次数为2次的工艺为最佳提取工艺，为其颗粒剂型的制备工艺提供了试验支持。

参考文献：

[1] 李宇铭. 厚朴七物汤并非表里同治[J]. 河南中医， 2011， 31（12）：1337-1339.

[2] 张新军，徐娟，吕美红等. HPLC法测定参苓颗粒中厚朴酚-和厚朴酚及甘草酸单铵盐含量[J]. 包头医学院学报，2015， 31（7）：151-152[3] 王昌儒. 基于厚朴七物汤及其母方对大鼠胃分泌功能的影响探讨合方的思想[J].环球中医药，2013，6（8）：593-595.

[4]王昌儒.桂枝去芍药汤、厚朴三物汤及其合方的实验研究[J].中国医院用药评价与分析，2008，8（6）：441一443.

[5]阴爱辉，周振理.浅谈《金匾要略》腹满五实方[J].山东中医药大学学报，2009，33（1）：23一24.

[6]王怀轩.厚朴七物汤加减治疗功能性消化不良62例[J].中国社区医师，2007，9（173）：87.

[7]刘亚辉.厚朴七物汤联合肠内营养支持治疗急性胰腺炎36例临床观察[J].河北中医，2013，35（6）.