大鼠前扣带回皮层吻侧部精确取样的方法

【摘要】 目的：自制大鼠脑组织取样模具，精确切取双侧大鼠前扣带皮层吻侧部。方法：（1）自制动物脑组织精确取样模具；（2）在低温下将大鼠脑组织冠状切为脑组织片；（3）按照自制取材模具上的定位标识将已切好的大鼠脑片摆放好，逐步对组织段切割，最终可得到样本量较精确的大鼠前扣带皮层吻侧部样品。之后即可进行该脑区的蛋白、核酸等其他方面的研究。结果：实验中切取不同个体大鼠脑组织的部位和体积基本一致，不同动物个体取样差异小，实验结果可比性更强，且切取的组织大小不因操作者不同而异。结论：自制大鼠前扣带皮层吻侧部精确取样模具的使用简便易行，取样部位、大小一致性好，方法经济可靠，使后续实验结果更准确；该方法可推广应用于大鼠其他脑区的取样或其他小动物脑组织的取样。

【关键词】 前扣带回皮层吻侧部； 脑组织； 自制取材模具； 精确取样； 大鼠

The Method of Taking the Rostral Anterior Cingulate Cortex Tissue Precisely from Rat Brain/WANG Yuan，QIN Xia，CHEN Jian-ming，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（17）：019-022

【Abstract】 Objective：To take the rostral anterior cingulate cortex （rACC） tissue precisely from rat brain with home-made rat brain cutting mold.Method：（1）The cutting mold was made by ourselves.（2）The rat’s brain was cut into coronary sections at low temperature.（3）After that，the tissue section was put on the home-made cutting mold according to the marked line，it might be cut step by step. We finally got accurate sample size at exact location from rACC brain area in rat.After the above，the following studies on the detection of protein or nucleic acid may proceed.Result：In this way，we got accurate rACC brain area sample tissues which were in the same size and location in rat， regardless of different individual experimental animals we used or each new experiment operator.Conclusion：Home-made cutting mold is easy to make and use， and it can be well applied to other brain area in rat or other small animals.

【Key words】 Rostral anterior cingulate cortex； Brain tissue； Home-made cutting mold； Taking accurate sample size at exact location； Rat

First-author’s address：Department of Physiology of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.17.005

在神经系统相关的基础医学和临床医学研究实验中，用分子生物学方法检测目标脑区或核团的核酸水平或蛋白表达时，需要对该部位进行定位准确、取样大小一致地快速局部取材。由于这些区域体积较小且在肉眼上不与周围组织有明显区分，实验者常规使用的估计取材的方法常常导致实际切取的组织大小、形状偏差较大，且易受受主观判断影响；不同动物个体间因操作者不同或取材时间不同而使样本之间取样的一致性较差，导致后续实验的结果误差偏大。目前国内外已有可购买的取材模具大多是切取冠状或矢状切片模具，并不能精确到某一层面上具体核团或脑区切取，使上述问题不能得到很好解决。

本实验室近几年的工作主要集中在大鼠前扣带回皮层吻侧部（rostral anterior cingulate cortex，rACC）神经元参与痛情绪反应的相关研究[1-5]，需要在大鼠上进行脑rACC区手术置管局部给药、行为学实验，之后切取rACC区组织进行western blot实验[6-13]，研究该部位相关蛋白表达情况，因此准确切取大鼠rACC区组织是研究的关键步骤。结合笔者在实验中的使用经验，在不影响实验规范性的前提下，自制了用于rACC区精确取材的模具，并设计了针对使用该模具的取材步骤，使实验更加简便、容易操作，取材范围更加精确且大小统一，在不增加大量实验成本的前提下就能提高实验结果准确性。以下就该模具的制作方法和取材步骤进行介绍。

1 材料与方法

1.1 实验器材

1.1.1 大鼠脑组织取材模具载物台 为无色透明的塑料或有机玻璃板材质（也可以用载玻片空盒或6孔板盖加工），厚度为0.8～1 mm；固定边框：同样为无色透明且能与塑料板固定在一起围成内有空腔的长方体（55 mm×30 mm×18 mm）；切刀导向槽：在载物台与固定边框相对的一面，长35～40 mm，宽0.1～0.2 mm，深度0.1 mm，槽内有黑色涂料覆盖；比例刻度尺：在载物台与固定边框同侧的一面，三条垂直比例刻度尺（25 mm）与一条水平比例刻度尺（40 mm）。

1.1.2 取材模具的制作 （1）首先在载物台与固定边框同侧的一面制作刻度比例尺：①第一垂直刻度比例尺位于载物台中央，与载物台宽边平行，用笔标好位置后用工具刀刻出凹陷，并以1 mm为单位刻出刻度；②水平刻度比例尺位于第一条垂直刻度尺的顶端与之垂直，并被平均分为左右两部分，其余制作同第一条垂直刻度比例尺；③第二、三条垂直刻度比例尺分别位于水平刻度比例尺两端，与之垂直，其余制作同第一条垂直刻度比例尺。（2）然后在载物台另一平面制作切刀导向槽：第一垂直切刀导向槽与第一垂直刻度比例尺位置相同，第一、二斜切刀导向槽为27 mm×0.1 mm，第一、二、三横向切刀导向槽为40 mm×0. 1mm，第一、二斜切刀导向分别与第二、三横向切刀导向槽和相交构成等腰梯形，第一横向切刀导向槽位于等腰梯形外侧。自制动物脑取材模具实物图见图1。

1.1.3 模具具体参数的选择 在笔者前期对大鼠脑局部双侧给药的目标位置为前扣带回皮层吻侧部（rACC），即为Bregama向前2.6 mm，左右旁开0.6 mm，深度是颅骨平面以下2.6 mm（体重在250～270 g的大鼠）。在选择模具具体参数时本着两个取材原则：一是包含给药部位，尽可能地将目标组织全部切取；二是在前者的基础上尽量使所切取的组织精确。按照Paxinos&Watson图谱，rACC的位置是图谱中cg1区[14-15]。于是笔者选择对Bregama前1～3 mm处的脑组织段进行进一步切取，针对这一位置模具具体参数为：（1）第一横向切刀导在槽距水平刻度比例尺下0.4 mm；（2）第二横向切刀导向槽在第一横向切刀导向槽下0.5 mm；（3）第三横向切刀导向槽在第二横向切刀导向槽下2.1 mm；

（4）以中央垂直比例尺为中线，左右旁开1.8 mm

处做与中央垂直比例尺平行的两条纵向切刀导向槽；（5）两条斜切刀导向槽分别是以第二横向切刀导向槽距中央垂直比例尺0.2 mm处、对侧纵向切刀导向槽和第三横向切刀导向槽交点为两点做直线制得。自制动物脑取材模具取rACC样本区域示意图见图2。

1.2 实验用品 常温生理盐水、戊巴比妥钠、注射器、粗剪刀、止血钳、烧杯、动物脑模具（瑞沃德，型号：脑模具-大鼠/175～300 g/冠状切片/1 mm/不锈钢）、碎冰、自制大鼠脑组织精确取样模具、切刀（飞鹰牌单面保安刀片）若干、滤纸、不锈钢药勺、0～4 ℃生理盐水、眼科镊、冻存管、液氮。

1.3 取材方法 （1）将大鼠按30～40 mg/kg剂量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉[16]；（2）断头并纵向剪开头部皮肤，去除颅骨和脑膜后，取出完整脑组织，将其放入0～4 ℃生理盐水中30 s进行降温[17-18]；（3）将冠状切片模具自制大鼠脑组织精确取样模具和刀片提前插入碎冰预冷；（4）使用动物冠状脑取材模具先切取Bregama前1～3 mm处的脑组织段，然后将脑组织段平放在载物台上，使脑纵裂与垂直刻度比例尺对齐，并保证整个切取过程始终对齐。将切刀卡入第一横向切刀导向槽，使大脑上缘在不挤压状态下紧贴切刀；（5）将切刀卡入第二横向切刀导向槽，取下第一横向切刀导向槽内切刀，去除两刀之间脑组织；（6）将切刀卡入第三横向切刀导向槽，取下第二横向切刀导向槽内切刀，两刀之间组织为需要部分，去除不需要的组织；（7）将卡在槽内的切刀左移，使其右缘在右侧纵向切刀导向槽和第三横向切刀导向槽交点，将另一切刀沿此交点所在的斜向切刀导向槽切割组织，另一侧同理。中间的小块组织即为大鼠脑扣带回皮层吻侧部组织；（8）在滤纸上吸去多余水分后将组织称重、放入冻存管，放入液氮速冻，之后放入-80 ℃冰箱保存[19]。

1.4 不同取样方法 让两名实验员各用两种方法（传统方法和精确取样法）分别取6只大鼠rACC区组织，使用本文所述方法切取的目的脑区组织，即图2中灰色阴影部分。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析和作图，计量资料以（x±s）表示，比较采用独立样本t检验，以P

2 结果

传统方法所取组织重量为（0.2106±0.062 39）g，

且所取组织间质量差异较大，精确取样法所取组织重量为（0.058 33±0.000 971 8）g，两种方法所取组织的重量比较差异有统计学意义（P0.05），结果如预期。

3 讨论

为精确切取大鼠目标脑区或核团以检测该部位核酸或蛋白质，需要尽可能使所切取组织精确，减小其他非目标核团内物质的干扰。在脑结构图谱中可确定具体目标脑区或核团的大小形状及空间位置，为精确切取组织提供了可能[20-23]。在本实验中，自主设计并制作的模具既能使所切取的组织在即使切取的时间不同，人员不同的情况下，都可取到更精确且相一致的组织；因其特殊的结构，切取过程可在低温环境中进行，从而降低组织内蛋白质的破坏程度，还可保证使载物台不易移动，且制作材料花费低、容易获得，不会过多增加实验成本，使后期实验结果能更准确、客观地反映整体研究事实。

在使用自制动物脑精确取材模具取材时，需要注意的有以下几个方面。（1）在使用动物冠状脑取材模具先切取Bregama前1～3 mm处的脑组织段时要注意在掀开前囟门后两块颅骨后，要及时对囟门处进行标记。由于此动物脑精确取材模具的参数是根据这一段脑组织选择的，所以准确标记前囟门可使切取的组织段不会过分靠前或靠后，以保证下一步使用模具取材的准确性。（2）在切取组织时，需注意组织在载物台上的位置，一定要对准各参照的比例刻度尺和切刀导向槽，这样才不会影响切取的准确性。（3）在切取时，包括起固定作用的切刀和切取组织的切刀，都要与载物台垂直，保证切后组织切面与载物台面的垂直。（4）操作时需要动作迅速，以降低组织内蛋白质破坏程度。（5）在切取过程中常会因为空气中的水蒸汽遇温度较低的器材和组织变成液态水，使组织表面因水分较多而在载物台上容易移动，或在称重时产生误差，这时需要用滤纸及时吸去组织表面水分。（6）以上实验过程所使用数据是根据Paxinos&Watson图谱确定的，适用于体重在250～270 g左右的SD大鼠。