肝癌患者外周血肿瘤相关抗原MAGE-A1 A3表达与意义

摘要：本文通过巢式RT-PCR方法检测60例HCC患者外周血单核细胞(PBMC)中MAGE-A1,A3mRNA表达，以30例健康志愿者外周血标本作为对照组，进行MAGE-A1,A3mRNA和AFPmRNA对比检测。结果显示MAGE-A1,A3在HCC患者外周血中高表达，可联合AFP作为特异性肿瘤标记物用于肝癌患者的检测。

关键词：肝癌，黑色素瘤抗原基因；巢式逆转录聚合酶链反应

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，早期发现与诊断是提高临床治愈率的有效手段。本试验采用巢式反转录聚合酶链法检测编码肿瘤相关抗原的黑色素瘤抗原(melanoma antigen，MAGE)MAGE-A1和MAGE-A3基因在HCC外周血中的表达，并对检测结果的临床意义进行了初步探讨。

1资料与方法

1.1一般资料实验组为2011年1月~2013年6月沈阳市第四人民医院肝胆外科收治的HCC患者60例，伴有乙型肝炎病毒阳性46例。男女比例为2:3，年龄38~72岁，平均56.3岁。患者均行手术完整切除病灶，并经术后病理证实。30例健康志愿者外周血标本作为对照组，男22例，女8例，年龄32~45岁，平均37.4岁。外周血标本的采集 HCC癌患者外周血(10ml)在术前1d采集。对照组血标本择期采集。使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。引物:根据Genbank数据库中所查MAGE-A1，A3基因序列，使用Omiga2软件设计引物。试剂:Trizol试剂购自美国Gibco公司，脱氧核苷酸（dNTPs)购自Pharmacia公司,RNA逆转录酶(MMLV)和TaqDNA聚合酶购自Promega公司。

1.2方法

1.2.1总RNA提取 取1×107个PBMC加入Trizol试剂1ml裂解，经三氯甲烷分层、异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤干燥后，将所得RNA溶于无RNA酶的纯水中，采用紫外分光光度计(Beckman公司.1DU 640)对其定量后再进行cDNA合成和RNA电泳。

1.2.2 cDNA合成 反应体系及反应条件为:MgCl2 4μL,10×Buffer2μL，dNTP2μL, Oligo(dT)1μL,RNasin0.5μL,AMV酶5μL,Template4μL,加无RNA酶的双蒸水补足20μL。42℃孵育30 min,95℃灭活酶活性5min,-20℃冻存备用。

1.2.3 Nested RT-PCR反应体系为:MgCl23μL，10×Buffer5μL,dNTP1μL，引物sense 1μL。引物antisense1μL。Taq聚合酶0.5μL，cDNA 5μL，加无RNA酶的双蒸水补足50μL。以MAGE-A1，A3，AFPmRNA为靶基因时，PCR循环条件参照文献[1，2]。终产物分别在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察DNA条带，凝胶成像分析仪照相。

1.3统计学方法 使用SPSS 10.0软件建立数据库，使用χ2检验和四格表确切概率法。

2结果

2.1 MAGE-A1，A3mRNA在HCC患者外周血中的表达情况RT-PCR电泳显示：所有内参照均为阳性。健康者外周血中未检测到MAGE-A1，A3mRNA的表达。60例HCC患者癌组织中MAGE-A1mRNA表达的阳性率为38.0%（23/60），MAGE-A3mRNA表达的阳性率为48.3%(29/60),AFPmRNA表达的阳性率为73.3%(44/60)均高于癌旁组织（0%）(P

2.2MAGE-A1，A3mRNA和AFPmRNA在HCC患者外周血中联合表达情况60例HCC中，至少表达1种MAGE基因的42例，表达率为70%；表达2种MAGE基因的19例，表达率为33%，58例HCC患者至少表达1种基因，表达率为96.7%。MAGE-A1mRNA/AFPmRNA阳性表达20例，表达率为33.3%。MAGE-A3mRNA/AFPmRNA阳性表达26例，表达率为43.3%。MAGE-A1,A3mRNA/AFPmRNA阳性表达16例，表达率为26.7%。

2.3MAGE mRNA表达与临床有关指标的关系60例HCC中MAGE-A1，A3mRNA表达与患者性别、年龄、有无包膜以及乙型肝炎病毒感染等指标无关(P>0.05)；与肿瘤大小及AFP水平存在相关性(P

3讨论

潜伏肿瘤细胞(OTC)是与患者预后有关的危险因素。肝癌患者外周血OTC的检测己经成为研究的热点。

本研究显示，60例HCC患者癌外周血中MAGE-A1，A3mRNA均有较高表达，70%至少表达1种MAGE基因。联合AFP检测后，96.7%的HCC患者至少表达1种基因，高于单一检测AFP的表达率（73%）。对比临床资料发现MAGE-A1，A3mRNA的表达与肿瘤大小及AFP水平均存在相关性，提示检测血清中MAGE-A1，A3基因的表达，可能作为HCC的辅助诊断指标之一。

对比国外的相关研究资料其MAGE-A1，A3mRNA表达率均明显高于本研究，这些差异与样品量的不同或患者的选择和地区的差异有关。国外报道的病例多为丙型肝炎病毒阳性。

综上，提示我们可以以MAGE-A1，A3基因作为HCC患者特异性肿瘤标记物,为HCC患者的诊断和治疗提供帮助。

参考文献：

[1]Kufer P,Zippelius A,Lutterbuse R,et al.Heterogeneous expression of MAGE-A genes in occult disseminatedtumor cells a novel multimarker reverse transcription-polymerase chain reaction for diagnosis of micrometastatic disease[J]．Cancer Res,2002,62,251-261.

[2]Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitivedetectionof circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood[J]．Cancer,1995,75,2214-2219.