不育症患者抗抗体ELISA 测定与临床应用分析

[摘要]目的：应用酶联免疫吸附实验，定量检测不育症患者血中抗总抗体（T-Ig）、IgG 和IgA 水平，提高检测结果对临床的参考价值。方法：采用ELISA方法测定T-Ig、IgA和IgG，制作标准曲线，行方法学考察并确定参考值范围及初步临床应用。结果：T-Ig、IgA和IgG 的测定上限可达500 U/ml；回收率在96.4%%～103%之间；批内重复性＜7.0%；参考值范围为T-Ig＜74.3 U/ml，IgA＜55.2 U/ml，IgG＜61.3 U/ml。经在临床的初步应用表明，在不育患者中T-Ig超过参考值上限的比例男性23.7%，女性31.1%，但二者无统计学意义。结论：血清中T-Ig与IgG 具有较好的相关性，而且与IgA有一定的相关性。可同时测定T-Ig和IgA对不育患者进行诊断。

[关键词]抗抗体；不育；定量分析

[中图分类号]R711 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2007）04（b）-098-02

不孕不育是当前生殖医学研究的一个热点，据调查，在我国已婚夫妇中，约有10%～15%的人因各种原因导致不孕不育，其中30%～40%与免疫性抗体有关。抗抗体（AsAb）在不育人群中有较高的发生率，AsAb的检测已成为诊断不育的一个重要指标[1]，其检测技术也得到发展和完善，其中酶联免疫吸附实验是较为常用的方法，但只能定性，而不能确定抗体类型水平[2-4]。就此，本文应用酶联免疫吸附实验，定量检测不育症患者血中抗总抗体（T-Ig）、IgG 和IgA 水平，提高检测结果对临床的参考价值，方便临床进行针对性治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象选择结婚2年以上、性生活正常、男性经男科检查和女性经妇科检查均排除器质性原因且无全身急慢性疾病的不育夫妇141例，其中男性80例，平均年龄（30.0±4.5）岁；女性61例，平均年龄（28.4±4.2）岁。经检查无全身急慢性疾病。选择无免疫性疾病者136例为对照组，其中男78例，平均年龄（29.91±4.52）岁，女58例，平均年龄（28.47±4.40）岁。

1.1.2 试剂由SERATEC公司提供，内含稀释缓冲液、标准品和质控物。

1.1.3 仪器Wells canMK2酶标仪；SPSS统计软件。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法测定血清抗（T-Ig）、IgA和IgG按厂商试剂盒使用说明书进行操作，同时加入6个值的标准品用于制作标准曲线和两水平的质控血清。

1.2.2 测定与计算用酶标仪，以空气为空白，450 nm波长下测定微孔板各孔的吸光度。用二次方程绘制标准曲线，根据标准曲线计算出各型抗体的含量。

1.2.3 方法学评价对测定的线性、精密度、回收试验和呈色稳定性进行研究。

1.2.4 确定参考值范围及初步临床应用用统计软件SPSS分别对对照组和研究组的T-Ig、IgA和IgG含量进行统计学处理，根据95%上限值，初步确定T-Ig、IgA和IgG的参考范围。

2 结果

2.1 测定的线性和标准曲线

500 U/ml的标准品用样品稀释液进行倍比稀释，浓度范围为15.62～500 U/ml，共6个浓度，分别进行抗体的测定。利用二次方程进行分析，结果T-Ig、IgA和IgG的测定范围可达500 U/ml，分析方程如下：T-Ig=-0.74+204.4ABS+66.5ABS2；IgA=-14.4+369.7ABS+0.94ABS2；IgG=2.3+127.6ABS+83.4 ABS2。以上3个方程均P＜0.01，r=0.999。

2.2 重复性试验

用两份高低浓度的血清，同时重复测定10次，结果见表1。

2.3 回收试验

在两份已知含量的血清中分别加入50 U/ml标准品，再测定含量，回收率结果见表2。

2.4 呈色稳定性

加入终止液后立即测定吸光度，然后把反应板置于室温避光处，每隔10 min测定1次吸光度，结果在30 min内吸光度降低10%。

2.5 参考值范围和初步临床应用

用统计软件SPSS分别对对照组和研究组的T-Ig、IgA和IgG含量进行统计学处理，对照资料为偏态分布，性别之间无差异。根据95%上限值，初步确定T-Ig、IgA和IgG的参考范围为：T-Ig＜74.3 U/ml；IgA＜55.2 U/ml；IgG＜61.3 U/ml。

不育症组的抗抗体T-Ig、IgA和IgG含量在男女之间无差别（P＞0.05），超过参考值上限者，男性为T-Ig 23.7%、IgA 17.5%和IgG 23.7%；女性为T-Ig 31.1%、IgA 23%和IgG 26.2%。

相关性研究表明，抗抗体T-Ig与IgG有较好的相关性，与IgA有一定的相关性。

3 讨论

抗抗体是机体产生的与表面抗原特异性结合的抗体，它通过凝集细胞、抑制通过宫颈黏液流向宫腔内迁移，从而降低生育能力。男性AsAb的形成与生殖道的损伤与梗阻有关。或输精管的黏膜表面有损伤，巨噬细胞进入生殖道，吞噬降解，并成为激活免疫网络的抗原，刺激机体产生AsAb。对于阴道黏膜完整的女性，一般不产生AsAb，但当阴道黏膜上皮损伤后，裂解物通过损伤处破口进入女方血液循环，同样可产生抗抗体，使宫颈黏液形成屏障，影响穿透而导致免疫性不孕[5]。

经方法学评价研究表明，T-Ig、IgA和IgG的测定在500 U/ml以下具有良好的线性范围，批内重复性为2.1%～7.0%，回收率在96.4%～103%之间，显色后避光保存30 min内吸光度变化稳定。本研究T-Ig超过参考上限的比例，男性为23.7%，女性为31.1%，与国内资料抗抗体的阳性率男性23%、女性29%[6，7]基本吻合，表明该法可靠准确，可在临床上推广应用。

由于AaAb在血清中的主要形式是IgG，其次是IgA，临床医生根据免疫球蛋白类型有不同的治疗方法，因而理想的检测AsAb的方法应该是既可确定免疫球蛋白类型，又可定量。只检测单一抗体不能提供准确丰富的实验室诊断信息，如3个项目均检测又将造成病人的经济负担。本文通过相关性研究表明，T-Ig与IgG有较好的相关性（T-Ig、IgA和IgG），与IgA有一定的相关性（r=0.5396）。因而检测AsAb时，可同时测定T-Ig和IgA，从而经济、准确地为临床医生提供诊断信息，将可能成为临床诊断不育症病因的重要辅助诊断方法。

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