VEGF—C在NSCLC中的表达及其临床意义

[摘要] 目的 血管内皮生长因子-C（VEGF-C）倾向于扩散至淋巴系统，被认为是最具特异性的淋巴管生成调控因子。本研究旨在探讨VEGF-C在非小细胞肺癌中的表达及临床意义。 方法 采用免疫组化检测70例非小细胞肺癌标本中VEGF-C的表达，以癌旁组织19例、正常肺组织20例为对照。 结果 VEGF-C在NSCLC中的阳性表达率为78.6%，明显高于在癌旁组织和正常肺组织的表达；淋巴结转移组的肺癌标本中VEGF-C阳性表达率明显高于在无淋巴结转移组肺癌中表达率；低分化组的肺癌标本中VEGF-C阳性表达率高于在中高分化组中表达率。Logistic回归分析显示肿瘤组织分化程度是VEGF-C蛋白阳性表达影响因素。 结论 VEGF-C在肺癌中有较高的表达率，且与淋巴结转移密切相关，提示VEGF-C与肺癌的发生、侵袭和转移存在相关性，可作为评估肺癌进展客观指标及预测肺癌淋巴转移的标志物。

[关键词] 肺肿瘤；免疫组织化学；血管内皮生长因子-C

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）32-0051-03

目前在世界范围内，肺癌已成为癌症死亡的主要原因，严重危害人类健康和生命[1]。肺癌死亡率仍高居癌症死亡第一位，远处转移是治疗失败的主要原因。肿瘤细胞侵袭和转移严重影响患者预后，然而肿瘤的这种生物学特性仍是研究难题。VEGF-C作为fms样酪氨酸激酶4的配体，倾向于扩散至淋巴系统，被认为是最具特异性的淋巴管生成调控因子。本研究采用免疫组化检测非小细胞肺癌组织及正常组织中VEGF-C表达，分析其在NSCLC中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取浙江省台州医院2004～2007年70例NSCLC患者住院行肺癌根治术标本，男52例，女18例，年龄35～80岁；所有病例术前均未接受化疗或放疗。标本按WHO肺癌病理组织学分型：腺癌34例，鳞癌36例；组织分化程度：低分化27例，高中分化43例；无淋巴结转移33例，淋巴结转移37例。肿瘤TNM分期：T1期18例，T2期41例，T3期9例，T4期2例。N分期：N0期33例，N1期28例，N2期9例。另取距肿块边缘1.5 cm的癌旁组织19例，距肿块边缘5 cm正常肺组织20例。

1.2 实验试剂与方法

兔抗人VEGF-C多克隆抗体购于美国INVITROGEN公司，Envision免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中杉生物公司。操作按试剂盒说明书进行，采用免疫组化Envision两步法，用高压热修复法，以已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 分级标准

染色强度及细胞阳性范围作为分级标准。细胞浆染色强度计分：无着色为0分，淡黄染色为1分，棕黄色为2分，棕褐色/胞浆内棕黑色颗粒为3分；细胞阳性范围计分：75%为4分；再将染色强度与阳性细胞率作乘积分级：>3分为（+），6～9分为（++），9～12分为（+++），凡（+）及其以上者为阳性表达[2]。

1.4 统计学方法

采用统计学软件SPSS 17.0进行χ2检验或四格表确切概率法，回归分析采用Logistic回归，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF-C染色结果

VEGF-C在不同肺组织中的表达见图1。VEGF-C阳性染色为黄色、棕黄色、棕褐色，定位于细胞浆和/或膜上。VEGF-C在NSCLC中的阳性表达率为78.6%（55/70），在癌旁组织以及正常肺组织中的阳性表达率分别为31.6%（6/19）、10.0%（2/20），组间差异有统计学意义（表1）。

2.2 VEGF-C的表达与NSCLC临床病理特征的关系

VEGF-C在淋巴结转移组中阳性表达率为89.2%；无淋巴结转移组VEGF-C的阳性表达率为66.7%%；组间差异具有统计学意义。中高分化组和差分化组组间VEGF-C的阳性表达率分别为69.8%、92.6%，组间差异具有统计学意义；VEGF-C在肺鳞癌和肺腺癌中阳性表达率分别为66.7%、91.2%，组间差异具有统计学意义。VEGF-C在肿块直径≤3 cm的癌标本中阳性表达率为63.2%，在肿块直径>3 cm的癌标本中阳性表达率为84.3%，组间差异无统计学意义；VEGF-C在男性/女性患者的阳性表达率分别为80.8%和72.2%，差异无统计学意义；在>55岁或≤55岁的患者中，VEGF-C的阳性表达率分别为82.6%和70.8%，差异无统计学意义；VEGF-C在吸烟者和不吸烟者中阳性表达率分别为81.3%、72.7%，差异无统计学意义（表2）。

2.3 VEGF-C表达与NSCLC临床病理特征Logistic回归分析

见表3。

将VEGF-C表达与各临床病理特征进行Logistic回归分析，全变量模型分析显示组织学分化程度入选回归方程（B=2.487，Exp（B）=12.030），对VEGF-C蛋白表达的影响具有统计学意义。采用向前逐步回归模型（选入变量P ≤ 0.05，剔除变量P > 0.10）分析，组织学分化程度和肿瘤大小两个变量入选回归方程，对VEGF-C蛋白表达的影响具有统计学意义，Exp（B）分别为11.797、0.663，详见表4。提示肿瘤的分化程度越低，肿瘤细胞表达VEGF-C水平越高；肿瘤大小的P < 0.05，但Exp（B）值靠近1，提示肿瘤大小与VEGF-C的表达可能无关。

3 讨论

肺癌是严重危害人类生命和健康的常见疾病，发病率和死亡率逐年上升，而非小细胞肺癌为最常见的病理类型，占肺癌的80%。肺癌患者术后常出现远处转移，成为影响患者预后主要因素[3]。肿瘤生长依赖于新生脉管的形成，肿瘤血管、淋巴管生成及侵袭是肿瘤转移的必要条件。淋巴转移是肺癌较为常见转移途径，随着淋巴内皮细胞标志物的发现，淋巴转移机制成为目前研究热点。

VEGF-C作为VEGF的家族成员，研究认为与肿瘤淋巴管生成、生长和转移密切相关，能增强肿瘤的淋巴管生成及侵袭能力，目前被认为是最具特异性的淋巴管生成调控因子。VEGF-C可与其受体VEGFR-3结合促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡并改变淋巴管生理特性。Liu等[4]研究发现VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表达与VEGFR-3的表达密切相关，促进外周新生淋巴管的生成。研究证实VEGF-C可以选择性地诱导淋巴细胞存活，促进瘤周及瘤内形成新的淋巴管，参与淋巴管的形成以及肿瘤淋巴转移。Veikkola等[5]通过转基因小鼠研究证实VEGF-C和VEGF-D与其配体VEGFR-3结合，启动VEGF-C/VEGF-D-VEGFR-3信号通路，使得皮肤淋巴管增殖，而且在功能上新生的淋巴管与正常淋巴管具有相似性。

正常人体组织中，VEGF-C主要在成人的呼吸道及消化道黏膜的内分泌细胞中有少量表达。目前研究证实诸如口腔癌、消化道肿瘤、肺癌、肾脏肿瘤、部分肉瘤、黑色素瘤、白血病细胞及乳腺癌组织等多种具有侵袭性的肿瘤组织细胞中存在VEGF-C表达。

研究发现Ⅰ期NSCLC中VEGF-C的阳性表达促进淋巴结微转移形成。在肺腺癌中VEGF-C的mRNA水平在淋巴结转移阳性组呈现升高的趋势。Ko等[6]研究报道VEGF-C在肺癌组织标本中阳性率为76.0%，且认为VEGF-C的阳性表达水平与患者淋巴结转移及不良预后呈正相关。Li Q等[7]报道同样认为肺癌中VEGF-C表达促使淋巴管新生，其表达水平与患者淋巴结转移密切相关，可作为肺癌进展客观指标及预测肺癌淋巴转移的标志物。Ishii等[8]实验表明高表达VEGF-C/VEGF-D的肺癌细胞株TKBS接种的裸鼠体内局部淋巴结的转移发生率远高于正常对照组。

本实验结果显示NSCLC和癌旁组织、正常肺组织的VEGF-C的阳性表达率分别为78.6%、31.6%、10.0%，其检验差异明显，提示VEGF-C在NSCLC发生、发展过程中可能起着重要作用。根据单因素分析，VEGF-C在肺腺癌中的表达明显高于肺鳞癌中表达，这与Ko等报道相一致。本研究中发现淋巴结转移组中VEGF-C的表达明显高于无淋巴结转移组中的表达，表明VEGF-C介导着肿瘤细胞淋巴转移，在淋巴转移途径中发挥重要作用。国内代学利等[9]的研究发现VEGF-C在肺腺癌病灶表达率（71.2%）明显高于在肺鳞癌组（41.0%），腺癌病灶新生淋巴管密度（6.20±3.81）个明显高于鳞癌组（3.95±3.18）个。结合本研究及临床，这可能与肺腺癌极易早期出现远处转移相关。单因素分析发现VEGF-C阳性表达与患者性别、年龄、肿块大小、吸烟情况无统计学意义。本研究进一步采用了Logistic回归分析，分析VEGF-C的表达与各临床病理因素的相关性。结果表明在肿瘤组织分化程度间VEGF-C差异明显，肿瘤组织分化程度是VEGF-C蛋白阳性表达的影响因素，分化程度越低，肿瘤细胞表达VEGF-C水平越高，说明VEGF-C与较高的恶性生物学行为有关。

上述研究结果表明，VEGF-C在NSCLC的发生发展中发挥重要作用，且与淋巴结转移密切相关，提示VEGF-C可作为评估肺癌侵袭、转移客观指标。

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[3] Pisters KMW，Le Chevalier T. Adjuvant chemotherapy incompletely resected non-small cell lung cancer[J]. J Clin Oncol，2005，23（14）：3270-3278.

[4] Liu B，Ma J，Wang X，et al. Lmpangiogenesis and its relationahip with lymphatic metastasis and prognodid in malignant melanoma[J]. Anat Rec，2008，291（10）：1227-1235.

[5] Veikkola T，Jussila L，Makinen T，et al. Signalling via vascular endothelial growth factor receptor-3 is sufficient for lymph angiogenesis in transgenic mice[J]. EMBO J，2001，20（6）：1223-1231.

[6] Ko YH，Jung CK，Lee MA，et al. Clinical significancer of vascular endothelial growth factors （VEGF）-c and-D in resected non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res Treat，2008，40（3）：133-140.

[7] Li Q，Dong X，Gu W，et al. Clinical significance of co-expression of VEGF-C and VEGFR-3 in non-small cell lung cancer[J]. Chin Med J，2003，116（5）：727-730.

[8] Ishii H，Yazawa T，Sato H，et al. Enhancement of poleural dissemination and lymph node metastasis of intrathoracic lung cancer cells by vascular endothelial growth factors （VEGFs）[J]. Lung Cancer，2004，45（3）：325-337.

[9] 代学利，王文利，申屠阳，等. 肺腺癌和鳞癌中VEGF-C和新生淋巴管表达的预后价值[J]. 中国肺癌杂志，2011，14（10）：774-779.

（收稿日期：2012-08-22）