液相色谱法同时测定茶叶中啶虫脒和多菌灵农药残留研究

摘要 建立了液相色谱法同时测定茶叶中啶虫脒和多菌灵2种农药的分析方法。茶叶粉碎后经乙腈提取后，Carbon/NH2小柱净化，紫外检测器测定，外标法定量。对比NH2和Carbon/NH2固相萃取柱净化效果，对样品前处理和色谱分离条件进行优化，综合考虑，确定茶叶中啶虫脒和多菌灵2种农药的检测方法。结果表明：2种混合农药含量在0.01～0.50 mg/L间呈良好的线性关系，相关系数r2=0.999以上。添加0.05～1.00 mg/L浓度，平均回收率在77.5%～83.4%之间，相对标准偏差（RSD）为5.5%～7.2%之间。方法最低检出限（S/N=3）啶虫脒0.01 mg/kg、多菌灵0.03 mg/kg。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农药残留测定的技术要求。

关键词 茶叶；啶虫脒；多菌灵；液相色谱法

中图分类号 TQ450.263；TS272.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）19-0122-02

Abstract A method based on liquid chromatography method was established for the simultaneous determination of two kinds of pesticides tea acetamiprid and carbendazim.Tea after crushing was extracted with acetonitrile，and purified with Carbon/NH2 column and UV detector，using external standard parison of NH2 and carbon /NH2 solid-phase extraction column purification effect，the sample pretreatment and the chromatographic conditions were optimized，considering the determined in tea of acetamiprid and bacteria spirit 2 kinds of pesticide detection method.The results showed that the contents of 2 kinds of mixed pesticides had a good linear relationship with 0.01～0.50 mg/L，and the correlation coefficient was above 0.999.When the concentration was 0.05～1.00 mg/L，the average recovery rate was in 77.5%～83.4%，the relative standard deviation（RSD）was 5.5%～7.2%.The detection limit（S/N=3）of acetamiprid 0.01 mg/kg and carbendazim 0.03 mg/kg.The sensitivity，accuracy and precision of the method were in accordance with the technical requirements of pesticide residue determination.

Key words tea；acetamiprid；carbendazim；liquid chromatography

茶叶是我国重要的经济作物，同时我国也是茶叶生产和茶叶出口大国，每年出口茶叶20万t左右，贸易金额约4亿美元[1]。2008年我国茶叶产销量达120万t，消费量84万t，可见茶叶与人们日常生活密不可分。随着我国加入世界贸易组织，发达国家和地区采用技术壁垒，以最高的标准来保护自身利益，进出口企业将直接面临因产品质量无法达到相关要求，导致经济损失。啶虫脒是中国茶叶种植中广泛使用的农药之一，是茶园登记用药，因为防虫效果好而被推广使用。2014年8月25日，欧盟将正式提高对进口中国茶叶的农药残留标准，该法规对茶叶需要检测的农药残留项目提出了新的要求。其中对我国茶农在茶叶种植中使用啶虫脒的限量值提高了1倍，在2013年啶虫脒的检测限量为0.1 mg/kg，而此次该农药的检测限量为0.05 mg/kg。我国食品安全国家标准《食品中农药最大残留限量（GB 2763―2014）》中并没明确规定茶叶中啶虫脒农药最大残留，而多菌灵农药在茶叶中的最大残留量为5 mg/kg。因此，除提高茶园使用农药的水平、发展和推广低毒无残留农药之外，尽快建立和完善茶叶及茶叶制品中农药残留检测技术和质量保证体系，已是当务之急[2]。

本试验通过简化样品前处理过程、选择合适的固相萃取小柱，建立了一种操作简单、实用性强，配合waters液相紫外双波长同时检测的功能，对啶虫脒、多菌灵2种农药同时分开检测，互不干扰，最大程度地发挥检测器的灵敏度，满足日常监测工作的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂。啶虫脒、多菌灵标样（农业部环境保护科研监测所100 μg/mL）；乙腈、甲醇、二氯甲烷（德国merck色谱纯）；氯化钠、磷酸、三乙胺（广州化学试剂厂GR）。

1.1.2 仪器与设备。电子天平（Precisa公司）；旋涡混合器（上海精科XW-80A）；振荡摇床（IKA KS501）；研磨机（IKA A11）；组织分散机（IKA T18）；氮吹仪（天津恒奥 HGC-24A）；离心机（Sigma公司3-30k）；Waters2695-2487液相色谱仪（带紫外检测器）；pH计（Sartorius PP-20-P11）；超纯水器（Millipore公司Mini-Q）；石墨碳黑/氨基复合小柱（Agilent Carbon/NH2 500 mg，6 mL）。

1.2 试验方法

1.2.1 提取。茶叶样品粉碎后过20目筛。称取试样2.0 g于50 mL具塞离心管中，加5.0 mL水浸泡5 min，加30 mL乙腈，组织分散机匀浆提取1 min，加5.0 g氯化钠，旋涡混合2 min。5 000 r/min离心5 min，取5 mL乙腈提取液在45 ℃氮吹仪吹至近干，用2 mL甲醇∶二氯甲烷（10∶90）旋涡溶解，备用[3-4]。

1.2.2 净化。将Carbon/NH2小柱用3 mL甲醇∶二氯甲烷（10∶90）预洗，不收集。待液面到达填料表面时，迅速加入提取备用液，再用3 mL甲醇∶二氯甲烷（10∶90）淋洗，重复1次，挤干，收集。45 ℃氮吹仪吹至近干后，用1.0 mL甲醇：水（1∶1）旋涡溶解，过0.2 μm滤膜，待测。

1.2.3 标准溶液配制。分别取1支啶虫脒、多菌灵标准品，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。相当于2种农药混合浓度为10 μg/mL标准储备液，-18 ℃保存，有效期1个月。再用甲醇∶水（1∶1）定容现配现用，相当于2种农药混合标准工作液0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL。

1.2.4 色谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×150 mm，5 μm；流动相：甲醇∶水（v/v）=45∶55；流速1.0 mL/min；检测波长：啶虫脒（246 nm）、多菌灵（282 nm）；进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 流动相选择

分别对比用三乙胺调pH值=3.6的0.1%磷酸水溶液+乙腈（85+15）、乙腈+水（20+80）、甲醇+水（45+55）作为流动相对啶虫脒和多菌灵的分离效果。试验结果表明，上述几种流动相都能分离啶虫脒和多菌灵，而考虑到对环境的影响因素和配制过程的复杂程度，选择毒性相对比较小、价格较便宜且配制过程比较简单的甲醇+水（45+55）作为流动相，出峰时间和峰形对称性较为理想，能与干扰峰完全分离（图1）。

2.2 提取溶剂的选择

茶叶中啶虫脒和多菌灵农药的提取溶剂有乙腈[3-4]、乙醚[5]，提取效果、回收率、精密度都比较满意。但乙醚根据《危险化学品安全管理条例》和《易制毒化学品管理条例》受公安部门管制，购买使用较为麻烦，而乙腈为实验室常规化学试剂，最后本方法使用乙腈为提取溶剂。市场上的茶叶一般经过加工烘干后包装，极少购买鲜叶直接冲泡饮用。方法通过对比乙腈直接提取与用水浸泡茶叶后再用乙腈提取作2组试验，一组直接用乙腈提取，另外一组按本试验1.2.1步骤操作，同时每组做3个平行。结果表明，水浸泡后的茶叶提取效果要优于乙腈直接提取。这可能是农药的极性比较大，水的极性大于乙腈的极性，水的渗透能力强于乙腈，所以加水浸泡后的茶叶中的农药更容易被有机溶剂提取[6]。最终，选择水浸泡茶叶后再用乙腈提取为本试验的提取方法。

2.3 固相萃取柱的选择

试验分别选取了6 mL的NH2、Carbon/NH2，做加标回收试验对比NH2与Carbon/NH2小柱，同时每种小柱做3个平行，选择平均回收率高的为净化柱。结果表明，Carbon/NH2小柱的净化效果要明显高于单一的NH2小柱。NH2小柱可以有效去除茶叶中部分色素、糖类等大分子，但茶叶本身天然色素较多，净化后的提取液颜色无明显变化，色素残留较多。而Carbon/NH2小柱，由于其非多孔性，对样品的吸附不要求其扩散至有孔区域，所以萃取过程非常迅速。且石墨碳黑中碳表面的正六元环结构，使其对平面分子有极强的亲和力，非常适用于很多有机物的萃取和净化，更有效地分离或去除茶叶中的大量色素和甾醇等。最后选择Carbon/NH2小柱为本试验的净化小柱[7-9]。

2.4 方法标准曲线、相关系数及检出限

在1.2.3色谱条件下，以峰面积为y值，标准溶液浓度为x值进行线性回归，求得线性方程。按本方法测定结果，以3倍信噪比（S/N=3）确定分析物的检出限，见表1。

2.5 回收率与精密度

取经检测不含啶虫脒和多菌灵2种农药的茶叶作空白基质添加一定量的混合标准品做添加回收试验，每个添加浓度重复测定3次，同时做空白试验。结果表明，添加平均回收率在77.5%～83.4%之间，相对标准偏差（RSD）为5.5%～7.2%之间（表2）。说明该方法具有较好的回收率和精密度，可以满足相关检测要求。

2.6 实际样品测试

在某市3家大型茶叶市场共购买20份茶叶样品，其中绿茶4份、红茶5份、铁观音6份、凤凰单丛2份、普洱茶3份，按照本方法测试，同时添加一定量标准品做加标回收试验。测试结果表明，20份茶叶样品中啶虫脒和多菌灵2种农药均未检测到。本方法具有样品前处理操作简单、准确性高和快速等特点，可以作为常规残留检测方法使用。

3 结论

试验结果表明，2种混合农药含量在0.01～0.50 mg/L间呈良好的线性关系，相关系数r2=0.999以上。添加0.05～1.00 mg/L，平均回收率在77.5%～83.4%之间，相对标准偏差（RSD）为5.5%～7.2%之间。方法最低检出限（S/N=3）啶虫脒0.01 mg/kg、多菌灵0.03 mg/kg。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农药残留测定的技术要求。

4 参考文献

[1] 苏婷.茶叶中啶虫脒残留检测方法及消解动态研究[D].合肥：安徽农业大学，2012.

[2] 李云春，易军，弓振斌，等.反相高效液相色谱法测定茶叶中氯氰菊酯和氰戊菊酯农药残留[J].厦门大学学报（自然科学版），2003（1）：78-82.

[3] 周希雷.高效液相色谱法检测蔬菜中啶虫脒农药残留量[J].中国民族民间医药，2012（11）：26-27.

[4] 刘景坤，武春媛，邓晓，等.液相色谱法同时测定豇豆中吡虫啉和啶虫脒残留[J].浙江农业学报，2014（1）：131-134.

[5] 徐艳，何健，季一兵.高效液相色谱法同时测定中药材亳菊中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的残留量[J].分析试验室，2011（7）：79-82.

[6] 王孝辉，宛晓春，侯如燕.茶叶中吡虫啉农药残留的液相色谱检测方法[J].茶叶科学，2012（3）：203-209.

[7] 温裕云，弓振斌，姚剑敏.柱后光化学反应荧光检测高效液相色谱法测定茶叶中的五种菊酯类农药残留[J].分析化学，2005（3）：301-304.

[8] 汤富彬，楼正云，陈宗懋，等.固相萃取-高效液相色谱法测定茶叶中有机氮农药残留量[J].理化检验（化学分册），2008（10）：947-949.

[9] 水果、蔬菜中多菌灵残留的测定高效液相色谱法：GB/T 23380-2009[S].北京：中国标准出版社，2009.