补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经功能及BrdU的影响

【摘要】目的 探讨补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经功能及BrdU的影响。方法 采用大脑中动脉线栓法建立右侧局灶性脑缺血大鼠模型，将动物随机分为正常组、假手术组、模型组和补阳还五汤组，腹腔注射Brdu，分别于1d、7d、14d和28d处死动物，采用免疫组织化学法观察Brdu表达情况。结果 正常脑内存在一定的BrdU阳性细胞，脑缺血后表达迅速增加，7天达高峰，然后逐渐下降；补阳还五汤可显著增强BrdU的表达，在第7d、14d时明显多于其它各组（P

【关键词】补阳还五汤 脑缺血 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 大鼠

中图分类号：R743.31文献标识码：A文章编号：1005-0515（2010）12-034-03

Effect of Buyang Huanwu Decoction on BrdU in Rats after Focal Cerebral Ischemia

【Abstract】Objective To explore the effect of Buyang Huanwu Decoction(BYHWD) on BrdU in rats after focal cerebral ischemia．Methods The model of focal cerebral ischemia in rats was reproduced by middle cerebral artery occlusion．Rats were randomly divided into following groups including navie,shame-operated,ischemia and Buyang Huanwu Decoction(BYHWD) groups．Animals were received BrdU-labeled and killed at 1,7,14 and 28 day point after operation.BrdU was measured by immunohistochemical staining．Result There was a certain BrdU positive cells in normal brain, after cerebral ischemia BrdU positive cells were increased and reached the peak at 7 day．BYHWD can significantly increase the expression of BrdU．The increase was statistically significant at 7 and 14 day point after ischemia（P

缺血性脑血管疾病日益危害着人类的健康，是高发且高危的脑血管疾病之一，尽快恢复缺血区的血供对神经功能的恢复至关重要。补阳还五汤是中医治疗缺血性脑疾病的有效方剂，能显著增强脑缺血后VEGF及其受体Flk1的表达[1]，本研究通过免疫组化方法观察脑缺血后BrdU的表达，探讨补阳还五汤是否可以促进脑缺血大鼠缺血区BrdU的表达。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 动物及药物 清洁级SD大鼠，体重250～300g，雌雄各半，购于北京实验动物中心。补阳还五汤处方来源于清・王清任《医林改错》，按原方：黄芪120g、赤芍10g、川芎10g、当归尾10g、地龙（研末）10g、红花10g、桃仁10g，中药饮片购自湖南省中医院，鉴定合格，按传统方法制备补阳还五汤汤剂并冷藏备用。

1.1.2 试剂及仪器 BrdU单克隆抗体购自美国Chemico公司；SABC试剂盒、AEC显色剂、PBS磷酸盐缓冲液（0.01M PH7.2～7.4）均购自武汉博士德生物工程有限公司。英国Thermo公司E60冰冻切片机；日本Olympus公司BX51光学显微镜及Image-Pro Plus 5.1（IPP5.1）图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药方法 50只大鼠造模成功后随机分为模型组、补阳还五汤组，另设正常对照组、假手术组各5只。造模成功动物术后分别存活1d、7d、14d、28d后处死，每组每个时间点各5只。补阳还五汤组动物于术后苏醒2h后起按4ml/kg，灌服补阳还五汤药液，每日1次；并按50mg/kg腹腔注射BrdU进行累积标记，前3天每天1次，之后每周2次，动物若死亡则随机补充，其他各组动物均给予等体积无菌蒸馏水。

1.2.2 动物造模及成功模型标准 采用刘等[2]改良的大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型，麻醉后颈部正中做一长约2.5～3.0cm的切口，在右侧颈总动脉远心端分叉处分离出颈内动脉和颈外动脉，结扎颈总动脉和靠近气管的颈外动脉，然后在颈总动脉分叉处近心端作一小切口，将一段一端钝圆的4-0尼龙线由颈总动脉插入至颈内动脉，感觉到有轻微阻力为止，大约进入17.0±0.5mm，结扎固定，缝合切口。假手术组仅切开皮肤，分离右侧颈总动脉后即缝合。正常组不做任何特殊处理。造模成功后表现为动物苏醒后提尾时左侧前肢内收屈曲，同侧Horner征，爬行时向左划圈，站立时左侧倾倒等。

1.2.3 神经功能评分 待清醒2h后按Longa等[3]的五级评分标准进行神经功能评分，0级：行为无明显变化―0分；1级：左前肢屈曲，左后肢伸展―1分；2级：有左侧追尾现象―2分；3级：行走困难，摇摆不定―3分；4级：无自发性活动，有意识障碍―4分。将第1、2、3级（1～3分）大鼠确定为成功模型分入各组。

1.2.4 标本处理 麻醉固定后充分暴露心脏，将注射用6号针头由心尖插入至主动脉并固定好针头，剪开右心耳，快速滴入0.01M PBS（约100ml），同时夹闭腹主动脉，待无血污流出后改滴4℃的4％多聚甲醛（大约200 ml）固定，先快后慢，取出大脑，固定后梯度脱水，冰冻切片，用于免疫组化BrdU酶学染色。

1.2.5 免疫组化及BrdU阳性细胞计数 切片放入3％H2O2去离子水中浸10分钟，PBS清洗后分别加入一抗BrdU抗体及二抗，AEC显色剂染色，贴片后封片。阳性细胞显色为红色，每只动物取海马部位不同断面切片5张，置于10×20倍光镜下，每张切片随机选取5个视野，用IPP 5.1图象处理系统自动计数阳性细胞，计算其平均值。

1.2.6统计学分析 所有数据以均数加减标准差（x±s）表示，应用SPSS 14.0统计软件对数据进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P

2 结果

2.1 补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响

见表1。正常组和苏醒2h后假手术组动物未见神经功能缺损，造模后各手术组动物都存在有明显神经功能缺损，提示造模成功，但神经功能评分差异无统计学意义。随着存活时间延长，各组动物积分逐步减少，提示动物存在一定的自我恢复能力。用药7、14d，补阳还五汤组降低神经功能积分作用与其它用药组比较差异有统计学意义（p

表1 补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响（x±ｓ）

注：与同期各组比较*P

2.2 补阳还五汤对脑缺血后BrdU的影响

见表2，图1。免疫组化结果显示的BrdU阳性细胞内呈棕红色深染，为细胞核染色，形态多样，胞核多为实性，呈圆形、椭圆形、梭形或不规则形，甚至有部分融合成团。正常组可见少量BrdU阳性细胞散在分布于各脑区，但数量少且排列比较稀疏。脑缺血后即可见BrdU阳性细胞增加，主要集中在梗死周围区、室旁区、皮质或脉络膜，排列不规整，胞体形状不一，7天时达高峰，而且排列紧密，然后逐渐下降，14天仍高于正常。补阳还五汤组细胞增殖规律与模型组一致，7d、14d时补阳还五汤组在阳性细胞数目上与同期各组比较具有显著性差异（P

图1 各组脑内BrdU+细胞表达（×200）

A正常组 B假手术组 C模型组 D补阳还五汤组

3 讨论

脑缺血后，由于得不到血液的营养，缺血区域的神经、血管等组织相继坏死，血液无法正常到达该区，造成该缺血区大脑所支配的功能受限。这时促进缺血区域血管新生，重建血液循环，供给大脑充足的血氧，恢复其神经功能和相应的感觉及运动神经元，就是亟待解决的问题。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是一种胸腺嘧啶脱氧核苷相似物，在细胞有丝分裂S期进入细胞单链，并被嵌入新合成的DNA中，故可用于有丝分裂标记，从而了解细胞的增殖状况。经免疫组化染色BrdU＋细胞胞浆呈棕红色，胞核呈紫褐色。Cai等[4]用标记BrdU的方法来追踪脑缺血后祖细胞的扩散，发现补阳还五汤可以促进缺血脑组织海马及脑室下区（SVZ）祖细胞的增殖，改善短暂局灶性脑缺血大鼠脑组织神经功能，减少梗死体积，刺激神经的增殖和调节VEGF及其受体flk1表达。

补阳还五汤是临床治疗缺血性脑中风的常用方剂，本研究初步证实：补阳还五汤可促进局灶性脑缺血大鼠缺血区BrdU的表达。本实验通过标记BrdU阳性细胞证实，补阳还五汤可以有效促进内皮细胞的增殖，其机理可能是补阳还五汤能有效恢复血管内皮细胞有丝分裂生长因子信号的传导，改善细胞外环境，说明补阳还五汤不仅有直接保护内皮细胞的作用，而且还可以通过改善细胞外环境的作用来间接保持内皮细胞的完整，并使其最终形成新的血管。国内其它研究也证实补阳还五汤可以通过调控促血管生成素-1及其受体的表达，来促进脑出血大鼠血肿吸收，改善脑组织循环，对血管的重建起到一定的作用[5]。本研究在上述研究成果的基础上得出补阳还五汤促血管新生的途径之一便是通过调控BrdU的表达来实现的。

参考文献

[1] 刘柏炎，蔡光先，等．补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后血管内皮生长因子及其受体Flk1的影响[J]．中草药，2007，38(3)：394-397．

[2] 刘柏炎，蔡光先，等．补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞影响的初步研究[J]．中国临床康复，2004，8(22)：4532-4533．

[3] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]．Stroke，1989，20(1)：84-91．

[4] Cai G，Liu B，Liu W，et al．Buyang Huanwu Decoction can improve recovery of neurological function, reduce infarction volume,stimulate neural proliferation and modulate VEGF and Flk1 expressions in transient focal cerebral ischaemic rat brains[J]．J Ethnopharmacol，2007，113(2)：292-299．

[5] 虢灿杰，唐涛，罗杰坤，等．益气活血法对脑出血大鼠脑组织促血管生成素-1及其受体表达的影响[J]．中国中西医结合急救杂志，2007，14(3)：138-141．

基金项目：湖南省自然科学基金（06JJ20054）资助