mir―223―3p在急性心肌梗死患者血浆中的表达特征及临床意义

摘要：目的 观察急性心肌梗死患者血浆mir-223-3p的表达情况，分析血浆mir-223-3p用于急性心肌梗死（AcuteMyoeardialInfraetions，AMI）临床诊断的可能性。方法 选择AMI患者29例，陈旧性心肌梗死患者31例，健康志愿者10例，入院后1h、24h、2d、7d分别抽取肘静脉血。real-timePCR检测mir-223-3p表达水平，改良szasz法检测CK-MB，免疫印记法检测cTnI。结果 AMI患者血浆mir-223-3p表达水平较陈旧性心肌梗死患者及健康组均显著升高（P0.05）。AMI患者入院1h血浆mir-223-3p表达水平已达到峰值，24h后明显降低，第2d基本进入平台期，并持续至第7d，但仍明显高于陈旧性心肌梗死患者与健康组入院时的水平（P

关键词：急性心肌梗死；mir-223-3p；CK-MB；cTnI

随着现代社会生活方式及饮食结构的改变，急性心肌梗死（AcuteMyoeardialInfraetions，AMI）的发病率逐年增加，在我国已成为一种严重危害人民群众健康的重要疾病。因此，对AMI的预防及治疗成为当前一项重要课题。近年来发现的miRNA与多种疾病的发生发展有着极为密切的关系。最近研究表明，miRNA广泛参与调控心血管系统的发育和疾病发生过程，并且具有较高的组织特异性，在外周血中可以稳定存在而不被分解，推测miRNA可能是一个理想的生物检测标志物。

1资料与方法

1.1一般资料 取得患者知情同意后，收集山东中医药大学附属医院心病科2012年8月～2013年12月，29例AMI患者（参照2012年ESC/ACC/AHA/WHF工作联盟修订后的第3版心肌梗死全球统一定义）、31例陈旧性心肌梗死患者、10例老年健康体检者。

1.2主要试剂和仪器 低温高速离心机（美国ThermoScientific公司），荧光实时定量PCR仪7300型（美国Appliedbiosystems公司），Trizol（美国Invirotrogen公司），TIANScriptRTKIT反转录试剂盒（北京天根生化科技公司），SYBRPremixExTaqTMreal-time-PCR试剂盒（大连TaKaRa公司），引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.3指标检测

1.3.1标本采集 分别于入院后1h、24h、2d、7d经肘静脉穿刺采集受试者外周血5ml，置于含EDTA的抗凝管中，静置30min；室温3000rpm离心15min，小心提取上清液分装到去RNA酶的EP管中，置于-80℃低温冰箱中保存待用。用于检测cTnI、CK-MB的外周血与用于miRNA提取的外周血同时采集，置于内含促凝剂（惰性分离胶）的真空采血管（BD公司生产）内，及时送化验室检验。

1.3.2real-timePCR检测mir-223-3p 按照Trizol途径提取总RNA，紫外测总RNA的纯度及浓度。根据逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；选用miR-93作为内参，逆转录引物序列如下：miR-223-3p：GSP：5'GGGGTGTCAGTTTGTCAAA3'，R：5'CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'；miR-93：GSP：5'GGCAAAGTGCTGTTCGTG3'R：5'CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'，注：GSP是对应miRNA的特异引物，R是与RT引物相匹配的引物。real-timePCR按照说明书进行操作；反应条件为：95℃，10min；40个PCR循环（95℃，10s；60℃，60s（收集荧光））。为了建立PCR产物的融解曲线，扩增反应结束后，按（95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s）；并从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行-RampRate为0.05℃/s）。获得产物扩增曲线与融解曲线及CT值。

1.3.3检测CK-MB、cTnI 应用改良szasz法检测CK-MB，采用免疫印记法检测cTnI。

1.4统计学分析 采用软件SPSS17.0进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差（Mean±SD）表示，计算各样本的Ct值（目的基因Ct值-内参基因Ct值），各样本的相对定量为2-Ct，mir-223-3p组间表达差异用2-Ct（Ct=Ct实验组-Ct对照组）表示，两组间比较采用独立样本T检验，多组间比较用方差分析，以P

2结果

2.1一般资料分析 本次试验纳入AMI患者29例，男16例，女13例，平均年龄（59.21±7.39）岁，陈旧性心肌梗死患者31例，男17例，女14例，平均年龄（58.74±6.91）岁，健康志愿者10例，男5例，女5例，平均年龄（56.63±4.89）岁。各组之间在年龄及性别构成上无统计学差异（P>0.05），消除了年龄及性别因素对试验结果的影响。为排除冠心病相关因素高血压、糖尿病、吸烟、高脂血症对mir-223-3p表达量的影响，分别对其进行统计学分析，结果各组之间mir-223-3p表达量无统计学差异（P>0.05）。说明mir-223-3p在外周血中的表达与冠心病危险因素无明显相关性。

2.2入院后各组受试者血浆mir-223-3p水平比较 AMI患者、陈旧性心肌梗死患者和健康者三组血浆mir-223-3p表达量比较，AMI患者入院后1hmir-223-3p表达水平较陈旧性心肌梗死患者和健康者均明显升高且有显著统计学意义（P=0.000，P

2.3AMI患者不同时间窗血浆mir-223-3p水平比较 AMI患者入院1h血浆mir-223-3p水平即达到峰值，入院24h开始降低，在第2d时下降趋势趋于缓慢，基本进入平台期，并持续到第7d。（见表2，图1）。

图1 AMI患者不同时间窗血浆mir-223-3pCt值

2.4 mir-223-3p与cTnI、CK-MB的相关性分析 动态监测AMI患者入院后1h、24h、2d、7dcTnI、CK-MB表达水平（见表3）。入院1h出现升高，24h达到峰值，第2d开始明显下降，第7d时进一步降低，并接近正常水平。结果提示mir-223-3p与cTnI、CK-MB表达水平在AMI入院早期均迅速升高，但mir-223-3p表达水平升高具有更早的时间窗以及更早的达峰时间（见图1～图3）。AMI患者血浆mir-223-3p水平与cTnI、CK-MB水平的Pearson相关性分析结果显示，mir-223-3p表达水平与cTnI和CK-MB均呈正相关，相关系数分别为（r=0.848，P=0.000）；（r=0.804，P=0.000）。（见图4）。

图2 动态监测cTnI表达水平变化

图3动态监测CK-MB表达水平变化

3讨论

近年来心血管疾病己经超过癌症成为威胁人类健康最主要的疾病，心血管疾病死亡率达16.77%，仅次于恶性肿瘤及脑血管疾病[1]。因此AMI早期及时、准确的诊断，采取积极有效的治疗措施保证心脏及时再灌注以减少死亡率及改善预后具有重要临床意义[2]。目前用于AMI临床诊断的血清生物标志物主要有CK-MB、肌红蛋白、cTn等[3，4]，然而考虑到上诉标志物在敏感性及特异性上的缺陷，对高敏感性及高特异性生物标志物的探求仍然是目前研究的焦点。近年来新发现的miRNA与心血管疾病的发生发展有着极为密切的关系[5～9]，miRNA具有较高的组织特异性、在血液中具有较高稳定性，推测miRNA可能是一个理想的生物检测标志物。

随着检测技术的不断改进，越来越多的miRNA被发现。大量动物实验发现，心肌梗死早期较正常组出现多种miRNA表达水平的异常，而且其表达水平具有明显的时效性，如miR-499[10]在大鼠心肌梗死1～3h开始升高，12h内

达到高峰，24h开始减少。另外，对miRNA-1[11]、miRNA-208[12]、miRNA-133[13]的相关研究亦显示miRNA有潜力作为心肌梗死标志物。并且随着心肌损伤及心功能的衰减，miRNA的种类及数量同样发生变化，这对于下一步研究相关miRNA的作用机制同样具有指导意义。

本研究从己经由AMI动物模型证实的相关miRNA中筛选出mir-223-3p，通过抽取AMI、陈旧性心肌梗死及健康体检者血浆中的mir-223-3p，经过逆转录及实时定量PCR检测出mir-223-3p在不同受试者间的差异性表达，进一步分析其对AMI的诊断作用。AMI患者、陈旧性心肌梗死患者和健康者三组血浆mir-223-3p表达水平比较，AMI患者入院后1hmir-223-3p表达水平较陈旧性心肌梗死患者和健康者明显升高且有统计学意义（P=0.001，P

虽然目前关于mir-223-3p的作用机制研究还没有相关文献报道，但这并不能否定它对AMI潜在的诊断价值，循环miRNA分子标志物将改变和补充传统AMI实验室诊断标准。尽管目前对循环miRNAs的研究众多，循环miRNAs在心血管系统中的生物学行为仍然是一个新的研究领域，作为AMI的诊断生物标志物仍有诸多问题尚待解决，例如：相关研究均存在样本量小，受试病种单一的缺陷，具体选择哪一种循环miRNAs作为AMI生物标记物也并不十分明朗，检测技术的操作过程相对复杂等。但是，循环miRNAs的发现为AMI的诊断和治疗提供了新的思路和方法，我们相信miRNA作为生物标志物是一个很有前途的研究领域，随着技术的进步和应用，这个时代一定会提前到来。

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