土槿皮药材定量方法研究

[收稿日期] 2014-06-27

[通信作者] *陆颂规，高级工程师，主要从事中药研制工作，Tel：（020）81157722，E-mail：

[作者简介] 陈丽斯，助理工程师，主要从事中药研制工作，Tel：13823402162，E-mail：

[摘要] 土槿皮为桃金娘科植物水翁Cleistocalyx operculatus的干燥树皮，是外用杀菌止痒药复方土槿皮酊的原料药材。目前土槿皮药材质量标准收载于《广东省中药材标准》（第2册），但其质量标准中仅有薄层鉴别项而无含量测定项，未能更有效地监控土槿皮药材的质量。该文首次建立反相高效液相色谱法测定土槿皮药材中3，3′-二-O-甲基鞣花酸峰，并用外标法计算其含量，结果在确定的色谱条件下，目标成分峰与相邻杂质峰达到有效分离，3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品溶液质量浓度在1.00～25.0 mg・L-1时峰面积呈良好线性关系，标准曲线为Y=77.33X+7.904，r=0.999 5；平均回收率为101.0%，RSD为1.3%。采用高效液相色谱法测定土槿皮药材中3，3′-二-O-甲基鞣花酸的含量，所建立的方法操作步骤简单，稳定性和重复性好，准确度高，可靠性强，能为更有效监控土槿皮药材质量提供了有力的技术支持。

[关键词] 土槿皮；药材监控；3，3′-二-O-甲基鞣花酸

土槿皮为桃金娘科植物水翁Cleistocalyx operculatus （Roxb.） Merr. et Perry的干燥树皮。历代本草对其记载较少，可在《生草药性备要》、《本草求原》和《岭南采药录》找到其较早的记载，其入药首见于清・何克谏著的《生草药性备要》[1]。《中药大辞典》、《广东中药志》、《中华本草》均将其收录入药，味苦、辛，性凉，功能清热解毒、燥湿、杀虫，主治脚气湿烂、湿疹、疥癣，疳疮，肾囊痈，烧烫伤[2]。自清至今，土槿皮用于杀虫、治癣有近300年的应用历史[3]，并有研究对其抗菌化合物进行分离与鉴定。现代土槿皮药材标准收载于《广东省中药材标准》（第2册），由于其质量标准过于简单，仅有薄层鉴别项而无含量测定项[4]，故本文制订一种测定土槿皮药材中3，3′-二-O-甲基鞣花酸含量的方法，旨在为土槿皮药材质量监控提供有效的技术支持。本次实验所用的含量测定指标性物质3，3′-二-O-甲基鞣花酸存在于土槿皮中，属于鞣花酸衍生物的一种，资料表明，鞣花酸具有抗氧化性、抗癌变、抗诱变[5]、抗突变作用，还兼备抗菌、抗病毒作用[6]，被广泛应用于食品、医药医疗和化妆品等领域[7]。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱系统（包括G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D DAD检测器和ChemStation色谱工作站）。

1.2 药材与试剂 3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品（含量98%，深圳市美荷生物科技有限公司）；土槿皮对照药材（中国食品药品检定研究院，批号1821-0301）；土槿皮药材（批号100602-2，110601-1，110601-2）产地为广西，取于广州白云山敬修堂药业股份有限公司，经广东药学院中药学院李书渊教授鉴定为桃金娘科植物水翁C. operculatus的干燥树皮；含量测定用甲醇为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Synergi Fusion-RP80A （4.6 mm×250 mm，4 μm）；流动相甲醇-0.3%磷酸水溶液（50∶50）；检测波长250 nm；流速1.0 mL・min-1；进样量10 μL；柱温30 ℃。

2.2 对照品溶液的制备 取3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取土槿皮药材粉末（过3号筛）0.25 g，精密加入70%乙醇50 mL，称重，超声（功率360 W，频率40 kHz）处理45 min，取出放冷，用70%乙醇补足失重，经微孔滤膜（0.45 μm）滤过取续滤液即得。

2.4 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，按照2.1项下条件进样测定，结果3，3′-二-O-甲基鞣花酸色谱峰与前后杂质峰分离度均大于1.5，峰纯度因子为999.945，理论塔板数大于5 000。对照品溶液与供试品溶液色谱图见图1，2。

1.3，3′-二-O-甲基鞣花酸（图2同）。

图1 3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品溶液HPLC图

Fig.1 3，3′-O-dimethylellagic acid standard solution HPLC chromatography

图2 供试品溶液HPLC图

Fig.2 The test solution HPLC chromatography

2.5 线性关系的考察 精密称取3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品约10 mg，置200 mL量瓶，加甲醇溶解后定容至刻度得3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品储备液（约50 mg・L-1）。准确量取储备液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于7个10 mL量瓶中，用甲醇配成3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品系列溶液，注入高效液相色谱仪。以质量浓度（mg・L -1） 为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品溶液的标准曲线为Y=77.33X+7.904，r =0.999 5，结果表明3，3′-二-O-甲基鞣花酸对照品溶液质量浓度在1.00～25.0 mg・L -1与峰面积呈良好线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，连续测定6次，记录峰面积并计算RSD，结果3，3′-二-O-甲基鞣花酸峰面积均值为813.2，RSD为0.87% （n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批土槿皮药材，按供试品溶液制备方法平行制备6份，依法测定，记录峰面积并计算RSD。结果6份供试品溶液中3，3′-二-O-甲基鞣花酸均值为0.076 4%，RSD为1.9% （n=6），表明该方法重复性良好。

2.8 供试品溶液稳定性试验 取同一瓶供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样分析，记录供试品溶液中3，3′-二-O-甲基鞣花酸的峰面积并计算RSD。结果表明24 h内3，3′-二-O-甲基鞣花酸平均峰面积为286.6，RSD为0.74%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收试验 称取6份已知含量的土槿皮药材粉末约0.125 g，分别精确加入对照品3，3′-二-O-甲基鞣花酸溶液。按供试品溶液的制备方法处理并进行测定，见表1，结果平均回收率为101.0%，RSD为1.3%（n=6）。

2.10 样品测定 按上述测定方法对3批土槿皮药材进行测定，结果3批土槿皮中含3，3′-二-O-甲基鞣花酸的含量分别为0.076 0%，0.073 3%，0.072 9%。

3 讨论

比较甲醇、60%甲醇、70%甲醇、乙醇、60%乙醇、70%乙醇等提取溶剂的超声、回流2种提取方法所得供试品溶液中3，3′-二-O-甲基鞣花酸的含量，选定溶剂种类为乙醇后，再以药材粉碎度、乙醇用量、乙醇浓度、超声时间作为正交试验的四因素，其下各设3个水平通过正交试验确定供试品溶液制备方案。

分别对甲醇-水，甲醇-磷酸水溶液，乙腈-磷酸水溶液，乙腈-水，甲酸-冰醋酸水溶液，其中用甲醇-磷酸水溶液流动相测定时，3，3′-二-O-甲基鞣花酸峰形良好，理论塔板数高，并且主峰与相邻杂质峰分离度好，其中对不同磷酸浓度（0.1%，0.3%，0.5%）进行考察，发现0.3%磷酸作为流动相水相时洗脱效果最佳，故选用甲醇-0.3%磷酸作为本实验含量测定的流动相。

本实验首次以化学对照品3，3′-二-O-甲基鞣花酸为指标性物质用高效液相色谱法测定土槿皮药材中该成分的含量，通过方法学的验证，表明该测定方法操作步骤简单，稳定性好，准确度高，可为有效控制土槿皮药材质量提供了有力的技术支持。

[参考文献]

[1] 曾颂，韩秀奇，李书渊.木槿皮、土荆皮、土槿皮本草考证及现代研究[J].广东药学院学报， 2011，27（2）：207.

[2] 罗清，梅全喜.广东省地产药材水翁花的研究概述[J].亚太传统医药，2009，5（2）：130.

[3] 房志坚，王瑾，罗集鹏.土槿皮与广东土槿皮的生药鉴定[J].中药材，1994（2）：15.

[4] 广东省食品药品监督管理局.《广东省中药材标准》.第2册[S].广州：广东科技出版社，2010：26.

[5] Stoner G D， Morse M A. Isocyanates and plant polyphenols asinhibitors of lung and esophageal cancer[J].Cancer Lett，1997，114：113.

[6] Kalt W， Forney C F， Martin A， et al. Antioxidant capacity， vitamine C， phenolics， and anthocyanins after storage of small fruits[ J]. J Agr Food Chem，1999，47： 4638.

[7] 陆晶晶，丁轲，杨大进.保健品功能因子鞣花酸研究进展[J].食品科学，2010，31 （21）：451.