杆菌肽脂质体的制备及其药物含量测定

[摘要]目的 制备杆菌肽脂质体，并采用HPLC法测定杆菌肽脂质体中杆菌肽含量和包封率。 方法 用薄膜分散法将杆菌肽制备成杆菌肽脂质体；色谱条件：色谱柱为Diamonsil-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5?m）；流动相为pH 6.0的磷酸盐缓冲液-甲醇（60∶40）；柱温为25℃；检测波长为254nm；流速为1mL/min。采用低温离心法分离杆菌肽脂质体中的游离药物。 结果 所制备的杆菌肽脂质体的平均包封率为87.94%（RSD 1.12%， n=5）；在本色谱条件下，杆菌肽在0.061～1.83?g范围内与峰面积积分值的线性关系良好（R2=0.9997），平均回收率为99.68%～101.38%。 结论 本HPLC法简单，准确可靠，可用于杆菌肽脂质体中杆菌肽含量及其包封率的测定。

[关键词] 杆菌肽脂质体；含量测定；包封率；高效液相色谱法

[中图分类号] R285.1 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）24-29-03

Preparation and the drug content determination of bacitracin Liposom

JIAO Yang1，2 YIN Shouyu1

1.Yanbian University College of Pharmacy，Yanji 133000，China；2.Affiliated Hospital of Beihua University， Jilin 132011，China

[Abstract] Objective To prepare bacitracin liposom，and to determine bacitracin content and entrapment efficiency of the liposome using HPLC method. Methods The bacitracin liposome was prepared by film dispersion method； The chromatographic conditions were Column： Diamonsil-C18 column（150mm×4.6mm，5?m）； mobile phase： pH 6.0 phosphate buffer： methanol （60∶40）； column temperature： 25℃； detection wavelength： 254nm； flow rate： 1mL/min.Refrigerated centrifugation using bacitracin liposomes free drug. Results The mean encapsulation efficiency of the bacitraci liposome was 87.94%（RSD 1.12%，n=5）；In the chromatographic conditions bacitracin and accessories and a good separation of the solvent peak，bacitracin at 0.061-1.83?g range had a good linear relationship （R2=0.9997），recovery was 99.68%-101.38%. Conclusion The HPLC method is simple， accurate and reliable，can be used to determine bacitracin content and entrapment efficiency of the bacitracin liposom.

[Key words] Bacitracin liposome；Content determination；Entrapment efficiency；High-performance liquid chromatography

杆菌肽的结构是由12个氨基酸组成的含有噻唑环的多肽复合体，主要用于金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌等敏感菌所致的皮肤软组织及眼部感染。杆菌肽易溶于水，但其水溶液不稳定，且因其具有严重肾毒性反应，现仅限应用于局部治疗[1-2]。脂质体（1iposome）主要由类脂材料（磷脂和胆固醇）、水、药等组成，具有在体内可生物降解、无毒性和无免疫原性、可增加药物的体内外稳定性、降低药物毒性和减少药物副作用等[3-5]特点。本研究将杆菌肽制备成脂质体，并采用高效液相色谱法测定其含量及其包封率。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC-SOLUTION色谱工作站（日本岛津），LC-10AVP高效液相色谱仪（日本岛津），MP200B电子天平（上海精密仪器有限公司），FA2004分析天平（上海精密科学仪器厂），超声波提取器（北京医用设备厂），LG16-B高速台式离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）。

1.2 试剂

杆菌肽对照品（中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯，美国），TritonX-100（美国），磷酸二氢钾（沈阳市试剂三厂），水为三蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 杆菌肽脂质体的制备

采用薄膜分散法制备杆菌肽脂质体[6]。按一定质量比称取胆固醇和大豆磷脂，加乙醚溶解，转移至梨形瓶中，再加入杆菌肽水溶液10mL（脂质质量与杆菌肽的加入量成一定比例），超声3min，使形成稳定的乳剂，减压蒸发至除尽乙醚。再滴加pH 6.5的磷酸盐缓冲液，漩涡震荡约2min，超声约3min，旋转水化约2h，即得。

2.2 脂质体中杆菌肽的含量测定

2.2.1 溶液的配制

2.2.1.1 对照品溶液 取杆菌肽对照品约20mg（杆菌肽效价61?g/mg），精密称量，置10mL棕色容量瓶中，用三蒸水溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45?m微孔滤膜，取续滤液作对照品溶液。

2.2.1.2 供试品溶液 离心样品溶液：精密吸取杆菌肽脂质体溶液0.1mL于离心管中，加三蒸水至1mL，在4℃以转速13000r/min离心90min，取上清液，用来测定脂质体溶液中游离药物的含量。

未离心样品溶液：精密吸取杆菌肽脂质体溶液0.1mL，加20?L 5% TritonX-100溶液进行破乳，用三蒸水稀释至1mL，摇匀，即得，用来测定脂质体中总杆菌肽的含量。

2.2.1.3 阴性对照溶液 除不加杆菌肽外，按2.1项下的方法操作，制备不含杆菌肽的空白脂质体，并以2.2.1.2项下“未离心样品溶液”的方法制备为阴性对照溶液。

2.2.2 色谱条件 色谱柱：Diamonsil-C18色谱柱（150mm× 4.6mm，5?m）；流动相：pH 6.0的磷酸盐缓冲液-甲醇（60：40）；柱温：25℃；检测波长：254nm；流速：1mL/min。理论塔板数以杆菌他吸收峰计算，应不低于2000。

精密吸取杆菌肽对照品溶液、杆菌肽脂质体（未离心样品溶液）和阴性对照溶液各20?L，进样，测定，结果见图1。结果表明，空白脂质体对杆菌肽的测定无干扰。

A

B

C

图1 杆菌肽对照品（A）、杆菌肽脂质体样品（B）、阴性对照（C）的HPLC图

2.2.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液7份，稀释成浓度分别为3.05、6.10、24.40、36.60、48.80、61.00、91.50?g/mL溶液，分别取20?L依次进样，测定。以峰面积积分值（y）对杆菌肽进样量（X，?g）进行回归处理，得到线性回归方程：y=3×106X+78 498，R2=0.9998（n=7），说明杆菌肽在0.061～1.83?g范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取杆菌肽对照品溶液，按照2.2.2项下条件测定，连续进样5次，每次20?L。结果平均峰面积积分值（为303 144）的RSD为0.5%。结果表明，仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取同一批号样品共5份，按2.2.1.2项下制备成未离心样品溶液，进样，测定，计算杆菌肽的含量，结果平均含量为62.19?g/mL，其RSD为0.33%（n=5），表明本法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取适量杆菌肽脂质体，按2.2.1.2项下制备成未离心样品溶液1份，分别于0、2、4、6、8、10、24h，进样20?L，记录色谱图。结果7个时间点的峰面积积分值（平均值为3 830 296）的RSD为0.13%（n=7），表明供试品溶液在24h内稳定。

2.2.7 回收率试验 取空白脂质体9份，分三组，分别加入杆菌肽对照品2.0、2.5、3.0mg，按2.2.1.2项下制备成未离心样品溶液，进样20?L，测定含量，计算回收率，结果见表1。结果表明，本法准确。

表1 回收率试验（n=3）

加入量（mg） 测得量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）

3.00 3.0480 101.60

3.00 3.0409 101.36 101.38 0.20

3.00 3.0356 101.19

2.50 2.4918 99.67

2.50 2.4854 99.42 99.68 0.27

2.50 2.4989 99.96

2.00 1.9970 99.85

2.00 2.0011 100.06 100.15 0.35

2.00 2.0106 100.53

2.2.8 包封率测定 取所制备的杆菌肽脂质体溶液100?L，每批3份，共5批，按2.2.1.2项下制备成“离心样品溶液”，进样，测定杆菌肽含量，乘以稀释倍数得样品中游离杆菌肽浓度Cf。另取杆菌肽脂质体溶液100?L，每批3份，按2.2.1.2项下制备成“未离心样品溶液”，进样，测定杆菌肽含量，乘以稀释倍数得到样品中总杆菌肽浓度Ct，按下面公式[7]计算包封率（EE%）：

结果，杆菌肽脂质体样品的平均包封率分别为87.94%（RSD 1.12%，n=5）。

3 讨论

本实验采用薄膜分散法制备杆菌肽脂质体。并对杆菌肽脂质体的含量测定进行研究，建立了HPLC法测定杆菌肽脂质体含量方法，实验结果表明本方法方便、快捷，为杆菌肽脂质体质量评价提供依据。

包封率是脂质体处方筛选与质量评价的重要指标。包封率的测定方法常见的有葡聚糖凝胶法、透析法、离心沉淀法等，均需要在测定过程中将游离药物与脂质体进行分离[8]。考虑到葡聚糖凝胶法、透析法在测定过程中需要将样品经历稀释，有使包封的药物发生泄漏的危险，或所需时间长等[9-10]，而离心沉淀法无需样品的稀释，测得的包封率更接近样品实际情况，适用于各种药物脂质体的包封率测定[9]，故本文用低温超速离心法，利用药物与脂质体在分散介质中的密度差，

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选择合适的离心时间和转速，有效分离游离药物，获得较为准确的包封率，有利于杆菌肽脂质体的处方筛选和质量评价。

脂质体流出液，用有机溶剂溶解脂质体膜，测定被包脂质体较稳定，选择TritonX-100溶液进行破乳，实验结果表明，其破乳效果较好。由于杆菌肽不耐高温，为此在测定脂质体中游离药物含量时，选择4℃下高速离心。杆菌肽是水溶性药物，因此以水作为溶剂。

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（收稿日期：2013-10-24）