p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用

[摘要] 目的 研究在C2C12细胞成肌分化过程中应力对丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路中p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路的影响。方法 将6孔Bio Flex培养板上贴壁培养的C2C12细胞，以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度，分别进行拉伸培养2、6、12、24 h，应用Western blot免疫印迹检测总p38和磷酸化p-p38（Thr180/Tyr182）蛋白的表达情况。结果 周期性机械拉伸在调控C2C12成肌细胞分化过程中，p38MAPK信号通路

被激活。p38MAPK信号通路蛋白磷酸化水平在较高水平；而p38MAPK通路总蛋白表达维持在一基线水平，各组之间差异无统计学意义。加入p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580后再加力，Myogenin的表达明显降低。结论 p38MAPK信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化过程中发挥重要作用，但不是这一调控过程的唯一通路。

[关键词] p38丝裂素活化蛋白激酶； 分化； 成肌细胞

[中图分类号] Q 257 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.004

在骨骼肌的发育过程中，成肌细胞发生两方面的成肌变化，一方面是成肌细胞增生；另一方面是增生的成肌细胞分化。成肌细胞的增殖和分化不仅是发育中形态构建的重要机制，也是成体形态维持的重要机制，这两者都受外界信号的调节。其中力学信号是骨骼肌形成和再生的重要外界因子[1-2]。但成肌细胞如何感知力学信号，从而特异性地激活其信号转

导途径，影响调控成肌调节因子（myogenic regulatory

factors，MRFs）的表达，对肌卫星细胞增殖分化的潜能发挥效应，目前还不得而知。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）级联反应是细胞内重要的信号传导系统之一。到目前为止，在真核生物细胞中已明确了5条MAPKs通路，分别为细

胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated

protein kinase，ERK）通路、c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）通路、p38丝裂素活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated

protein kinase，ERK）3/4和ERK5亚家族。研究发现：p38MAPK能被多种细胞外的刺激因素激活，包括机械压力、炎症性细胞因子及生长因子等[3-4]。p38MAPK是p38MAPK通路中的核心蛋白，它的活性受其上游丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein

kinase kinase，MAPKK）的调控。MAPKK通过磷酸化p38MAPK蛋白Thr-Gly-Tyr（TGY）位点中的苏氨酸和酪氨酸使其活化，活化的p38MAPK进一步磷酸化下游的蛋白激酶和转录因子，调控多种基因的表达，从而参与调控p38MAPK信号通路。本实验旨在研究在应力介导的C2C12细胞成肌分化过程中，应力对MAPKs信号通路中p38MAPK信号通路的影响；并通过观察p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580对C2C12细胞成肌分化的影响，进一步明确p38MAPK通路在应力诱导C2C12细胞成肌分化中的作用，为阐明应力诱导成肌细胞分化的力学信号转导机制提供实验学基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C2C12小鼠成肌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM高糖培养液（Hyclone公司，美国），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），胰酶-乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）（北京Solarbio公司），SB203580（Sigma公司，美国），p-p38（Thr180/Tyr182）antibody、p38

antibody（Cell signaling公司，美国），HRP标记羊抗兔IgG、Myogenin/β-actin（Santa Cruz公司，美国），6孔Bio Flex特制细胞培养皿（Flexcell公司，美国），多通道细胞牵张应力加载系统（哈尔滨工业大学研制），

Bio-rad凝胶成像系统（BIORAD Gel Doc2000，Bio-rad公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 C2C12小鼠成肌细胞力刺激培养模型的建立

取传至第3代生长良好的C2C12小鼠成肌细胞，胰酶消化后吹散，细胞计数后调整浓度至每毫升5×104个，接种于6孔Bio Flex特制细胞培养板中，每孔加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。培养板上细胞贴壁培养48 h后，将生长培养基换为分化培养基，在分化培养基中继续培养1 d，以促进细胞分化，让细胞充分融合（细胞融合接近85%），并同步化，避免细胞融合

对实验结果的影响。然后在无菌条件下，将培养皿与多通道细胞牵张应力加载系统连接，对卫星细胞施加不同时间的张应变刺激。各加力组每天分别对待测细胞加载2、6、12、24 h的张应力和压缩力，力值为10%，频率为0.5 Hz。对照组放在同一孵箱内进行培养，不进行离心加力，其余条件相同。实验组与对照组同时种板，各重复3次。

1.2.2 阻断剂预处理及细胞加载方案 为进一步明确p38MAPK信号通路在C2C12成肌细胞分化中的作用，将p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580加入实验组，按说明书的要求将阻断剂稀释为20 μmol·L-1，保存待用。在6孔Bio Flex培养板上贴壁培养48 h并同步化后，换用含有阻断剂的DMEM培养液对细胞进行预处理，然后以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度进行拉伸培养24 h。对照组放在同一孵箱内进行培养，不进行离心加力，其余条件相同。各组重复3次，加力结束后分别收获细胞。

1.2.3 Western blot免疫印迹检测p38MAPK信号通路蛋白表达水平 按蛋白提取试剂盒裂解细胞，提取细胞蛋白定量，按每孔10 μg·L-1蛋白量上样，电泳

2 h后电转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，以50 g·L-1脱脂牛奶/TBST封闭1 h。将孵育磷酸化一抗p-p38（1∶1 000）显色曝光过的PVDF膜置于抗体洗脱液中，50 ℃下摇床振摇60 min；TBST洗涤10 min×3；重新加入总蛋白一抗p38（1∶1 000）孵育，余步骤同前。同上方法准备HRP标记羊抗兔IgG（1∶2 000），室温孵育，余步骤同前。

1.2.4 Western blot免疫印迹检测周期性张应力以及p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580对成肌素（Myogenin）蛋白表达水平的影响 按蛋白提取试剂

盒裂解细胞，提取细胞蛋白定量，按每孔10 μg·L-1蛋白量上样，电泳2 h后电转至PVDF膜上，以50 g·L-1脱脂牛奶/TBST封闭1 h。将孵育磷酸化一抗Myogenin（1∶1 000）显色曝光过的PVDF膜置于抗体洗脱液中，50 ℃下摇床振摇60 min；TBST洗涤10 min×3；重新加入总蛋白一抗β-actin（1∶1 000）孵育，余步骤同前。同上方法准备HRP标记羊抗兔IgG（1∶2 000），室温孵育，余步骤同前。

1.2.5 主要观察指标 主要观察指标：1）细胞形态学观察；2）采集p-p38及p38免疫印迹图分别记为Ap-p38、Ap38，p38的磷酸化程度用Ap-p38/Ap38，即磷酸化与总蛋白条带灰度分析比值表示；3）Bio-rad凝胶成像系统采集Myogenin及β-actin蛋白免疫印迹图像，Quantity one图像分析软件进行灰度分析，分别记为AMyogenin、Aβ-actin，目的条带与内参照条带的比值AMyogenin/Aβ-actin表

示Myogenin相对含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件对数据进行分析，每一样本重复3次。实验结果以x±s表示，对Western blot免疫印迹数据进行方差分析和配对t检验。

2 结果

2.1 细胞形态学观察结果

在倒置荧光显微镜下观察可见，对照组细胞为长梭形，呈无序排列。而加载后2 h和6 h，相比对照组细胞排列规则，但仍不明显；而加载后12 h和24 h，细胞明显顺应其应力方向，呈有序排列（图1）。

2.2 在C2C12细胞成肌分化过程中周期性机械拉伸

对p38MAPK活性的影响

周期性机械拉伸在调控C2C12成肌细胞分化过程中，p38MAPK信号通路被激活。与相应的对照组比较，p38MAPK信号通路蛋白磷酸化水平在加力2 h后增加，加力6 h后磷酸化水平达到峰值（P

2.3 张应力及SB203580对Myogenin蛋白表达的影响

周期性张应力促进C2C12成肌细胞分化过程中Myogenin的表达，与对照组和加力+SB203580组相比，差异有统计学意义（P

3 讨论

3.1 应力控制成肌细胞分化的信号转导通路

近年来，随着骨骼肌再生、损伤后修复与适应性改建的研究受到广泛关注，有关骨骼肌细胞的增殖、凋亡和分化在骨骼肌再生中的作用研究也逐渐兴起。细胞外基质的一些信号参与调控成肌过程，其中力学应激是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激，它能够调节细胞的新陈代谢和基因表达过程，在骨骼肌的形成和发育中起重要的作用[5-8]。

近年来，对细胞响应力学刺激潜在机制的研究已发展成为重要的生理学研究的新领域[9]。通过对力

学刺激作用于肌卫星细胞增殖分化的研究，证实了不同的力学刺激所激活的信号通路并不完全相同，正是通过这些特异性信号转导通路的激活、封闭或者不同通路之间的cross-talk途径，从而对成肌转录因子及骨骼肌标志性蛋白的表达进行调控，对肌卫星细胞的增殖分化能力产生影响。研究证实：周期性张应力通过激活其下游信号分子——黏附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和RhoA，在调控成肌细胞增殖和分化中发挥重要作用[10]。Charrasse等[11]研究表明：M-钙黏附分子介导的信号途径参与了成肌细胞相互融合形成肌管的过程。Ku-mar等[12]却发现周期性拉伸可通过FAK、Rac-1、G蛋白及核因子-κB等信号分子抑制C2C12成肌细胞分化成肌小管。另外，Formigli

等[13]的研究证实：应力活化型离子通道在成肌过程中起重要作用。笔者在成功构建SD大鼠乳鼠成肌细胞体外培养力学刺激模型的基础上，研究了肌细胞膜上重要的Na+通道蛋白—Na+-K+-ATPase在力学信号转导中的重要作用及其调控机制。研究发现：周期性张应力通过内涵体转运促进成肌细胞膜上Na+-K+-ATPase α亚基蛋白的表达，并改变Na+-K+-ATPase的功能活性。笔者研究证实：Na+-K+-ATPase是成肌细胞感受力学信号并进行跨膜转导的重要信号分子[12，14-15]。然而，关于何种信号途径在应力介导的成肌细胞分化中起主要作用，迄今为止还没有被完全认识。由于MAPKs信号转导途径是细胞外信号引起细胞核内反应的主要通道之一，参与细胞的形成、运动、凋亡、分化及生长增殖等多种生理过程[16]，故本研究选用

MAPKs信号通路。

3.2 成肌细胞与MRFs

MRFs是骨骼肌胚胎发育过程中发现的一组转录调节因子，MRFs家族共有4个成员：MyoD、Myf25、Myogenin、MRF4。这些MRFs共有一个与E2蛋白转录因子家族结合形成二聚体所需的DNA结合域bHLH、MRF2E蛋白异二聚体和MRF单体结合到共有的E2盒序列CANNTG，而CANNTG存在于骨骼肌成肌特异基因的增强子元件中，调控着这些成肌分化特异因子的转录活性。MyoD和Myf25之间是成肌分化的决定因子，在成肌细胞分化前表达，两者的作用都是诱导前成肌细胞分化成成肌细胞。MyoD基因是骨骼肌细胞分化的决定性基因，是肌分化的发动者，它们是骨骼肌最早的成肌标志之一。Myogenin和MRF4均在分化中表达，作用都是诱导成肌细胞分化融合成肌管。增殖的成肌细胞在分化激活之前表达MyoD和Myf25，一旦分化被激活MyoD和Myf25则诱导细胞推出细胞周期，同时表达Myogenin。Myogenin和MRF4调节成肌细胞进一步终末分化为肌管肌纤维。Myo-genin基因敲除的小鼠因成肌细胞不能融合成肌管而无肌肉形成，MRF4敲除的小鼠有正常的肌肉形成，但因Myogenin的表达量增加，可导致新生小鼠肋骨严重畸形。因此Myogenin是成肌分化必不可少的因子[17-18]。实验性肌损伤时，12 h以内MyoD在细胞增

殖标志的增殖细胞核抗原表达前迅速上调，而Myo-genin在融合和分化期间持续表达，因此实验对于成肌分化的研究常选择检测Myogenin的表达变化。

3.3 p38MAPK通路与成肌细胞分化的调控

MAPKs级联是细胞内重要的信号转导系统之一。到目前为止，在真核生物细胞中已明确了5条MAPKs通路，每个亚家族又包含多个亚型。p38MAPK是哺乳动物中发现的第三种细胞外信号转导系统，其信号转导途径是近年来细胞生物学研究的热点之一[17]。在静止的细胞中，p38MAPK定位于细胞质与细胞核，活化的p38MAPK进一步磷酸化下游的蛋白激酶和转录因子，调控多种基因的表达，最终导致细胞的分化和凋亡及多种细胞反应[19]。p38MAPK信号通路是

生物信号引起核反应的重要通路，在细胞生长、死亡、细胞周期、炎症及其应激反应的调控中起着至关重要的作用。通过磷酸化多种转录因子，导致蛋白合成、细胞表面受体表达、细胞骨架重构。

p38MAPK通路在成肌细胞分化中起着重要作用。de Angelis等[19]研究表明：在成肌细胞分化过程中，

p38MAPK活性增强，使肌细胞增强因子2磷酸化，从而增强其转录活性。Lluís等[20]也发现：p38可以激活MyoD，从而直接参与成肌细胞分化早期调控。此外，p38MAPK促进了p21的表达，p21通过抑制周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）的活性，促使细胞从细胞周期中退出，促进细胞进一步分化[21]。同时，p38MAPK通路也是骨骼肌感受机械刺激的重要信号通路[22]。因此，笔者推测：p38MAPK可能在

应力调控成肌细胞分化过程中起重要作用，而且其分子机制尚未阐明。明确p38MAPK信号通路在应力介导的成肌细胞分化中的作用及其激活机制，为探讨通过干预p38MAPK信号通路的激活促进细胞分化具有积极意义。

本实验结果发现：周期性机械拉伸在调控C2C12成肌细胞分化过程中，p38MAPK信号通路被激活，蛋白磷酸化水平在加力6 h内达到峰值；继续加力，蛋白的表达稍有下降，但仍然维持在较高水平。而总p38MAPK蛋白表达维持在一基线水平，各组之间差异无统计学意义。通过本实验可得出：p38MAPK信号通路参与了应力调控成肌细胞分化的过程，在应力介导的C2C12成肌细胞分化中起重要作用。

上述结果尚不能够说明p38MAPK信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化中的唯一性，但至少肯定参与了此调控过程。为了进一步确证p38MAPK信号通路的重要性以及唯一性，笔者使用p38MAPK信号通路的特异性阻断剂SB203580，从反面进行印证。结果发现：周期性张应力促进C2C12成肌细胞分化过程中Myogenin的表达，加入SB203580后再加力，Myogenin表达明显降低；但加力+SB203580组与对照组比较差异仍有统计学意义，提示p38MAPK信号通路是参与应力介导的C2C12成肌细胞分化调控过程的信号通路，但不是唯一通路；其他的信号通路也可能参与这一过程，需要深入研究。

由此可见，应力调控成肌细胞分化的信号通路的相关研究是非常复杂的，而机体对于这一过程进行调控的精确性也是非常有意义的，对于深层次上阐明应力调控成肌细胞分化的相关机制是非常重要的。因为这一机制的阐明，将为探讨通过干预信号传导通路调控成肌细胞分化，抑制其凋亡，从而促进肌肉再生和肌肉改建提供理论依据，而且也为航天员失重性肌肉萎缩的防治提供新思路，因而具有深远的科学意义和潜在的应用前景。

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