乙型肝炎病毒cccDNA检测方法的建立及初步应用

[摘要]目的：建立和应用聚合酶链反应法(PCR)检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)。方法：应用选择性PCR的方法检测30例乙肝患者肝组织中cccDNA，同时验证此方法的特异性。结果：31例慢性乙型肝炎患者肝组织中，10例HBV cccDNA阳性，阳性率为32.3％。HBV cccDNA阳性组的ALT、HBV DNA、和HBeAg水平均明显高于阴性组(P

[关键词]乙型肝炎病毒；共价闭合环状DNA；聚合酶链反应；慢性乙型肝炎

[中图分类号] R512.6+2　[文献标识码]A　[文章编号]1673－7210(2009)02(c)－016－03

在感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cc－cDNA)，不与蛋白共价结合。cccDNA是嗜肝DNA病毒科病毒基因组的复制中间体，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板，虽然其含量较少，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，是嗜肝病毒持续感染的关键因素。因此，我们选择其特异性引物，建立了乙肝病毒肝组织的cccDNA检测方法。

1　材料与方法

1.1研究对象

慢性乙型肝炎患者肝组织标本31例和2例HBV DNA阳性肝癌肝组织标本；HBV DNA阳性血清标本1例，HBV DNA含量为107 copies/ml；HBV DNA阴性血清标本和HBV阴性肝组织标本各l例作为阴性对照，－70℃保存。诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。

1.2仪器

PCR自动循环仪，AG－9600 Thermal Station，AcuGen Sva－terns。

1.3引物的设计和合成

由于松弛环状DNA(rcDNA)的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不会被扩增，而cccDNA由于为完整的双链结构，则可以被选择性扩增，通过GENERUN软件设计一对跨越缺口的最佳引物，BA3为：5’－CCG ACC ACG GGG CGC ACC TCT CTI"TAC G－3’，BA4为：5’－CAA GGC ACA GCT TGG AGG CTT GAACAGT－3’，扩增目的基因片段为373 bp。

同时，另设计一对引物，正义引物和反义引物均位于负链缺口下游双链区域，能同时扩rcDNA和cccDNA。BAl为：5'－GCC TCC AAG CTG TGC CTT G－3’；BA2为：5’－TCT GCGACG GCG ATT GAG－3’。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.4实验方法

1.4.1肝组织匀浆制备　取肝组织100－200 mg于样品管中，用干净的剪刀将组织块剪碎，加NS约500μl，匀浆30s，放人离心管中，离心10min(2000 r/min)。

1.4.2　PCR扩增HBV cccDNA在10μl模板中加入PCR反应液40μl，混匀。50 μl反应体系中，含10xPCR buffer，引物BA3和BA4各200ng/ml，镁离子终浓度为2mmol/L，dNTP终浓度为200 μmol/L，TaqDNA聚合酶为2U。混匀离心，覆盖灭菌液体石蜡油。PCR条件为：94℃预变性5 min，然后按以下参数扩增：94℃，45s；55℃，45s；72℃，45s，共35个循环，72℃延伸5min，最后4℃∞，得到PCR产物。整个实验过程均设阴性及阳性对照。

1.4.3 PCR产物的检测用1％琼脂糖电泳，0.5μg/ml溴化乙锭(EB)染色后，与标准分子量对比，PCR产物的预计分子量为373 bp。

1.4.4特异性检测取上述乙肝患者血清、HBV DNA阳性肝癌患者肝组织以及HBV阴性肝组织标本和阴性血清标本，用BA1/BA2进行扩增，反应总体积为50μl，循环参数为：94℃，5min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，45s，共38个循环，72℃5min。扩增产物用2％琼脂糖电泳，得到PCR产物。

1.5统计学方法

数据以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验或X2。检验进行分析，P

2　结果

2.1 PCR扩增HBV cccDNA检测见图1。

2.2特异性检测

用引物BA3/BA4进行PCR检测时，1例乙型肝炎患者血清和1例阴性血清标本以及HBV阴性肝组织标本PCB阴性，而2例HBV DNA阳性肝癌患者肝组织PCR阳性。当用上述样品行普通PCR扩增时，BA1/BA2扩增1例阴性血清标本和HBV阴性肝组织标本仍为阴性，1例阳性血清标本和2例HBV DNA阳性肝癌患者肝组织标本为阳性。

2.3临床标本检测结果

31例慢性乙型肝炎患者肝组织中，10例HBV cccDNA阳性，阳性率为32.3％。

2，4肝组织HBV cccDNA阳性组与阴性组血清HBV标志及生化指标比较

由表1可见，HBV cccDNA阳性组的ALT、HBV DNA载量均明显高于阴性组(P

3　讨论

HBV感染肝细胞的标志是HBV复制中间体。包括共价闭合环状DNA(cccDNA)、单链DNA(single－stranded DNA，ssDNA)以及HBV mRNA，通常eccDNA检测方法为South－em印迹杂交，步骤繁琐，检测周期长达3－4d；放射性标记探针可能造成环境污染和健康损伤，而非放射标记探针敏感性又较差。因此，1996年Koek J等设计特异性引物，以PCR方法检测eccDNA取得成功，并被广泛应用。

eccDNA是嗜肝DNA病毒科病毒基因组的复制中间体，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板，通常情况下，HBV感染宿主肝细胞后,HBV基因组进入肝细胞核内为不完整的双链环状结构，即rcDNA。HBV rcDNA解脱负链5’端连接的末端蛋白，正链5’端的RNA残段，以HBVDNA聚合酶延长正链，将各链的缺口补平，最后转变成HBV cccDNA的形式。

本实验依据HBV DNA的复制原理，环状HBV基因组缺口部分正、负链的序列，分别设计两对引物。当用跨越两个

缺口的引物去扩增eeeDNA，应当得到特异性的扩增产物，以HBV DNA为模板，不应该出现阳性产物，而以负链序列引物扩增两种模板应都出现阳性结果。本实验结果证实了这一点，用引物BA1/BA2去扩增HBV阳性血清和HBV DNA阳性肝癌组织标本，均得到特异性产物，HBV阴性血清和HBV阴性肝组织标本PCR扩增结果为阴性。当用引物BA3/BA4行PCR时，HBV DNA阳性肝癌组织标本为阳性，HBV DNA阳性和阴性血清均为阴性，同时HBV阴性肝组织标本也为阴性。

HBV cccDNA被认为是HBV复制的模板，目前更倾向于检测肝内HBV cccDNA作为抗病毒疗效的终点观测指标。与肝内总的HBV DNA相比，HBV cccDNA能更精确地反应病毒存在及复制状态。本研究结果显示，血清中HBV cccDNA检出率与ALT和HBV DNA水平明显相关，HBV cecDNA阳性的慢性乙型肝炎患者，其ALT和HBV DNA载量均显著高于阴性组(P

有研究发现，70％以上中度或重度乙肝患者血清eccDNA都呈阳性，说明乙肝患者病情轻重和乙肝病毒复制的强弱有一定的关系。从理论上推测，当肝脏组织处于炎症活动阶段时，存在于肝细胞胞质和线粒体中的转氨酶等酶类在肝细胞被破坏时释放到血液中，那么存在于肝细胞核内的cccDNA分子在肝细胞变性、坏死时应该也可以释放到血液中，而且病情越严重，变性坏死的细胞越多，对于同一位患者而言，在某一时间段内，其血液中的cceDNA水平应该也相应地越高。因此，HBV cccDNA水平对判断病情有意义。

目前，评价抗病毒药一般采用比较治疗前后血内病毒载量降低多少的方法。但血清HBV DNA不能真实地反映肝组织内HBV感染及复制情况，而cccDNA的检测被认为是目前评价抗乙肝病毒疗效或临床治愈的金标准。进一步加强对体内eceDNA的检测，对于确定抗病毒治疗的最佳治疗方案、时间、治疗终点等具有重要意义。从一定意义上说，只有彻底清除HBV cccDNA的药物，才能算是真正有效的抗病毒药物。