鹅细小病毒延边株VP3基因原核表达质粒构建

摘要:本试验根据GenBank已公布的鹅细小病毒B株基因序列,设计了一对扩增VP3基因的特异性引物,对鹅细小病毒延边分离株基因组DNA进行了PCR扩增,得到了约为1500bp的vp3基因片段,将其回收纯化后与pMD-18T simple载体连接,然后进行克隆,经双酶切分析、PCR鉴定及测序,验证了所克隆的基因是鹅细小病毒VP3基因。用EcoR I和XhoⅠ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-1原核表达载体中,获得重组质粒PGEM-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析,证实了重组质粒的正确性。

关键词:鹅细小病毒;VP3基因;原核表达

Abstract: Specific primers for VP3 amplicafion

was designed according to the publiced goose parvovirus strain B gene sequence in GenBank.The genome DNA was amplified by PCR, which amplified a fragment about 1500 bp.It was purified and connected with pMD-18T simple vector and then transformed to E.coli BL21 competent cells for cloning, cutting by two-enzyme,then PCR and sequencing to identify.The result showed that the cloning gene is the goose parvovirus VP3, then got the fragment and prokaryotic expressionby vector by EcoR Iand BamH I digestion .And obtained recombinant plasmid PGEM-VP3 by linking prokaryotic expressionby vecto r PGEM-4T-1,and identified by PCR、double restriction enzyme analysis and sequence analysis,the result showed that it’s true.

Key words:gosling plague virus; VP3 gene; prokaryotic

前言

鹅细小病毒病俗称为小鹅瘟,是由鹅细小病毒引起的主要侵害4-20日龄雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性和败血性传染病[1,2] 。由于该病病程短,传播速度快,死亡率高,是目前危害养鹅业健康发展的最重要的传染病之一,造成了相当大的经济损失。从而引起了国内外学者的高度重视[3,4]。其中VP3是该病毒的主要衣壳蛋白和重要保护性抗原,且可以诱导机体产生免疫反应[5-7]。本研究利用原核表达载体PGEM-4T-1,构建鹅细小病毒VP3基因原核表达质粒,目的在于将体外表达的基因作为免疫原,为研制鹅细小病毒VP3基因亚单位疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒与菌种

GPV为本实验室从延边某养鹅场发生小鹅瘟的病死鹅脾脏中分离的病毒。将该病毒液用生理盐水适当稀释后,尿囊腔接种于12-14日鹅胚,收集72-120h内死亡的鹅胚尿囊液,4℃,5000r/min离心30min,取上清,-20℃保存备用。感受态菌BL21由本实验室保存并提供。

1.1.2主要试剂

限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、蛋白酶K、IPTG、X-gal、酵母提取物、胰蛋白胨、Amp、Marker(DL2 000、DL1 5000)、DNA凝胶回收试剂盒、ExTaq、rTaq均购自宝生物(大连)生物工程公司。SDS、Tris饱和酚和低熔点琼脂糖购自上海生物工程技术服务有限公司。原核表达载体PGEM-4T-1由本实验室保存并提供。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,针对VP3基因保守区,利用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0软件设计合成了一对引物,由宝生物(大连)生物工程公司合成,扩增片段长度约为1500bp,序列如下:

P1:5′- CGC GGATCC GCC GAT GGA GTG GGT AAT GCC T - 3′

P2:5′- CCG CTCGAG CTG GTG AAC TGG ATT TCT GGG - 3′

1.2.2病毒核酸的提取

病毒核酸的提取按文献(5)方法进行。

1.2.3VP3基因PCR扩增

PCR反应体系:灭菌去离子水:12.3µL,10x PCR Buffer:2µL,dNTP:1µL,P1:1µL,P2:1µL,鹅细小病毒DNA:2.5µL,Ex Taq:0.2µL。PCR反应程序:95℃预变性5min,94℃变性1min,53℃退火45s,72℃延伸2min,进行35个循环,最后于72℃再延伸5min。电泳鉴定:取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,-20℃保存备用。

1.2.4PCR产物的克隆

取50µL阳性PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收VP3基因片段。将回收的VP3基因与克隆载体pMD-18T simple进行连接,连接产物转化至BL21感受态细胞中。挑取转化后的阳性白色单菌接种于5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中,37℃振荡培养过夜,然后用质粒小量制备法提取质粒。将提取的重组质粒分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定和PCR鉴定。

1.2.5序列测定与分析

将鉴定阳性的重组质粒菌液送至上海生物工程技术有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN、DNAstar软件进行核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析。

1.2.6 目的基因与表达载体的连接和转化

将酶切的目的基因与载体按3:l的体积混合,在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜,将连接产物转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞涂布平板,挑取单个白色菌落提取质粒进行酶切和PCR鉴定。命名为PGEM-VP3。

2 结果

2.1 VP3基因PCR扩增

产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在1500bp处有一明显的条带,与预期片段大小相符,结果见图1。

Fig 1 PCR amplification result of VP3 gene of GPV

M:DL2 000 DNA Marker;1:鹅细小病毒标准株DNA扩增产物; 2:病料中鹅细小病毒DNA扩增产物; 3:阴性对照:健康雏鹅脏器上清基因组DNA;4:空白对照:灭菌的去离子水

2.2重组质粒pMD18-VP3的PCR鉴定

将提取的重组质粒进行PCR扩增,在1500bp处有一清晰的条带,与预期片段大小一致,结果见图2。

Fig 2 Electrophoresis of amplification of recombinant plasmid YB

M:DL2 000 DNA Marker;1-2:重组质粒PCR扩增产物

3:阴性对照:健康雏鹅脏器上清基因组DNA;4:空白对照:灭菌的去离子水

2.3重组质粒pMD18-VP3双酶切鉴定

重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切得到两条特异性基因片段,一条约为1 500bp,另一条

约为2 700bp,所得结果与理论值相符。(见图3)

Fig 3 Electrophoresis of resis of recombinant plasmid YB digested

by BamH Ⅰ and XhoⅠ

M1:DL2 000 DNA Marker; M2:DL 15 000bp DNA Marker;

1,2: BamH Ⅰ and XhoⅠ 双酶切鉴定:片段大小约为1 500bp和2 700bp

2.4重组质粒pMD18-VP3的测序鉴定

测序结果与GenBank中发表B株的序列同源性为96.5 ,说明目的基因(VP3)已经被成功克隆到pMD18-T Simple载体上。

2.5 重组质粒pGEX-VP3的PCR鉴定和酶切鉴定

对初步筛选为阳性的重组亚克隆质粒为模板进行PCR扩增鉴定和双酶切鉴定,结果与预期结果相符。

Fig 4 Identification for pGEX -VP3 by PCR and restriction enzyme digestion

M1:DL2 000 DNA Marker; M2:15000bP DNA Ladder Marker;

1: BamH Ⅰ and XhoⅠ 双酶切鉴定:片段大小约为1 500bp和4 900bp

2:重组质粒PCR扩增产物

3 讨论

由于原核表达系统常受到目的基因本身结构、转录水平调控和蛋白质折叠诸多因素的影响,本研究所用的融合表达载体pGEX-4T-1,该载体带有非常强的tac启动子,融合蛋白表达系统可以克服转录与转录后水平对外源基因表达带来的不利影响,是一种高效的蛋白表达载体,GST标签便于目的蛋白的进一步纯化。

VP3是鹅细小病毒主要衣壳蛋白,约占衣壳蛋白总含量的80%,能够刺激机体产生中和抗体,Zadori等通过GPV与AAV2衣壳蛋白三维结构模拟比较分析发现,VP3可能是暴露于鹅细小病毒表面的多肽,内含有鹅细小病毒主要抗原决定簇成分,是鹅细小病毒主要免疫保护性抗原,能诱导机体产生具有中和作用的抗体。因此本试验以pGEX-4T-1为载体,构建了pGEX-VP3原核表达质粒,为亚单位疫苗的构建奠定了基础。

参考文献:

[1] 方定一.小鹅瘟介绍[J].中国畜牧兽医杂志,1962,8:19-20.

[2] 陆承平.兽医微生物学[M]. 北京:中国农业出版社,2001,361-362.

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[4]殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社,1997.165-168.

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[7] 萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].第三版.北京:科学出版社,2OO2.

作者简介:金东春(1969-),男,朝鲜族,延边大学农学院动物医学系,博士。

第二作者简介:杜秋明(1986―),男,汉族,吉林省舒兰市人,延边大学农学院动物医学系预防兽医学专业,在读硕士. 研究方向:动物传染病。

基金项目:吉林省牧业管理局项目;项目编号:吉牧科字第200902号;