一种新型水合肼荧光比率探针的合成及应用研究

摘 要 基于激发态分子内质子转移的过程，设计合成了一种新颖的水合肼比率荧光探针―2-（苯并[d]噻唑-2-基）苯基-4-氧代戊酸甲酯（HBT-RCO），通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）进行了结构表征.荧光光谱研究表明：在水合肼存在下，探针HBT-RCO的荧光光谱显著红移，且显示出比率荧光光谱特征，最大荧光强度比值（I483/ I385）增强约14倍.利用I483/ I385与水合肼浓度的比例关系实现对水合肼的定量检测.

关键词 比率荧光探针；2-（苯并[d]噻唑-2-基）苯基-4-氧代戊酸甲酯；水合肼；激发态分子内质子转移

中图分类号 O657.3 文献标识码 A 文章编号 1000-2537（2015）03-0047-06

肼（N2H4）常用作火箭推进剂、电池燃料以及有机合成[1-4]. 然而，肼易渗透皮肤组织或经口腔进入人体，破坏组织器官和神经系统[5-6].美国环保署规定肼的阈值为10 ppb[7]. 我国国家环境标准规定地面水和渔业水中肼的最高允许质量浓度10.0 μg/L[8].

肼的检测方法很多，如：气相色谱法、高效液相色谱法和电化学检测等[9-12]，但是，这些方法设备昂贵，操作繁琐.荧光光谱分析因其具有高效、快速、灵敏度高等特点深受关注[13-19].如Choi[20]等设计出一种以香豆素为荧光团的基于光诱导电子转移（PET）的off-on型荧光探针用于肼的检测.但大多荧光探针都是单一的荧光增强或者猝灭，很难消除背景干扰.

比率荧光分析是利用荧光探针本身的发射波长处的荧光强度和与待测物反应后在另一发射波长处的荧光强度的比值作为检测信号来检测物质的一种方法[21].由于比率荧光探针以两个波长处荧光强度的比值作为信号参量，可以减少因探针浓度、设备以及样品环境等因素不可避免引起的误差，进而提高了选择性、灵敏度[22-23]，在一定程度上解决了传统采集单一波长信号的探针分子存在的缺陷.

基于激发态分子内质子转移机理（ESIPT），我们开发设计出一种水合肼荧光探针，该探针中2-（2-羟基苯基）苯并噻唑（HBT）的羟基被乙酰丙酸保护起来，加入水合肼之后，与之发生环化和消除反应，探针荧光发生变化，最大吸收峰红移，而且紫外激发下呈现黄绿色荧光，从而可以实现对水合肼的比率荧光检测.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

试剂：2-羟基苯甲醛和2-氨基硫酚均购于上海德默医药科技有限公司，氨基磺酸和乙酰丙酸购于均购于安耐吉化学试剂公司，二氯亚砜、无水硫酸钠、乙腈和乙醇均购于国药集团化学试剂公司，均为分析纯试剂.丙酮和二氯甲烷均进行绝对无水处理，分析实验中均用二次蒸馏水，乙酸乙酯和石油醚均为常压蒸馏产物，硅胶（50～75 μm）经烘干处理.

仪器：PL303电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司），ZNCL-G磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司），DZF-6050真空干燥箱（上海飞越实验仪器有限公司），N-1001旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），Bruker AVB-500核磁共振仪（瑞士Bruker公司），TU-1221紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），F-7000荧光分光光度计（日本Hitachi公司），PHS-3C 数字酸度计（上海鹏顺科学仪器有限公司）.

1.2 探针的合成与表征

本文探针设计合成按照图示1所示路线，主要分为两步：第一步通过加成消去合成2-（2-羟基苯基）苯并噻唑（HBT）；第二步通过取代反应将新制的乙酰丙酰氯与HBT反应，得到目标分子.

1.3 2-（2-羟基苯基）苯并噻唑（HBT）的合成

将2-羟基苯甲醛 （1.17 g ，9.58 mmol） 和2-氨基苯硫酚 （1.20 g， 9.58 mmol） 溶解在乙腈中 （20 mL），加入氨基磺酸作为催化剂（0.074 g， 0.074 mmol），在室温下搅拌反应3 h.反应过程用薄层色谱点板监控，得到固体物质，减压抽滤，然后水洗，最后将粗产品用乙醇重结晶，得到纯品 （1.85 g， 85.0%产率）.1H NMR （500 MHz，CDCl3-d6），δ 12.52（1 H，s），7.96（1 H，d，J=1.0 Hz），7.89（1 H，d，J=1.0 Hz），7.69（1 H，d，J=1.0 Hz），7.48（1 H，d，J=1.0 Hz），7.39（2 H，m，J=3.0 Hz），7.10（1 H，t，J=1.0 Hz），6.95（1 H，d，J=1.5 Hz）.

1.4 探针2-（苯并[d]噻唑-2-基）苯基-4-氧代戊酸甲酯的合成

先将乙酰丙酸 （464.5 mg， 4.00 mmol） 溶解在 SOCl2 （2 mL）中，在 N2保护下回流4 h. 用油泵抽干未反应完全的SOCl2 ，得到的油状物在冰浴下溶解在丙酮中（10 mL），加入合成得到的2-（2-羟基苯基）苯并噻唑 （227.3 mg， 1.00 mmol） 和碳酸钾 （552.8 mg， 4.00 mmol），在 N2 保护下室温搅拌，反应混合物倒入 20 mL CH2Cl2 ，然后用水洗3次. 收集有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去二氯甲烷，得到的粗产品用石油醚和乙酸乙酯混合液硅胶柱过柱分离，得到纯品 （246.1 mg ，75.6%产率） .1H NMR （500 MHz，CDCl3-d6），δ 8.19（1 H，d，J=1.0 Hz），7.95（1 H，d，J=1.0 Hz），7.76（1 H，d，J=1.0 Hz），7.36（2 H，t，J=2.5 Hz），7.24（2 H，dd，J=2.5 Hz），7.13（1 H，d，J=1 Hz）2.90（2 H，t，J=1.5 Hz），2.76 （2 H，t，J=1 Hz）2.06（3 H，s）；13C NMR（500 MHz， CDCl3-d6）， δ：206.19，171.07，162.36，152.86，148.12，135.23，131.31，130.08，126.30，126.21，125.87，125.25，123.63， 123.21，121.26，37.74，29.71， 28.61； MS（ESI+）[M+H]+：326.

2 结果与讨论

2.1 探针光谱性质及其对水合肼的响应机理

从图1可以看出，在只含有10 μmol/L探针时，探针分子本身的最大发射峰在385 nm，加入水合肼之后，荧光最大发射峰从385 nm红移至483 nm，呈现出比率荧光的特点，可用于定量检测水合肼.

基于对有机化学反应基本规律的认识，我们推测，水合肼存在下，HBT-RCO荧光探针与水合肼之间发生了图示2所示反应，由于肼的两个N原子含有孤对电子，具有很强的亲核性，其中一个氮原子先进攻乙酰羰基碳发生加成反应，然后脱水成腙；另一个N原子进攻酯羰基碳，发生分子内环化，电子转移，脱去六元环，释放出HBT，酚羟基的H可与噻唑环的N原子形成分子内氢键，发生激发态内质子转移，导致了最大荧光发射红移，且在483 nm处出现新的荧光发射峰.

2.2 水合肼检测条件的优化

2.2.1 反应时间考察 为了达到最优检测效果，对探针与肼的响应时间做了考察.在室温下，将3种不同浓度的肼（分别是10，60，400 μmol/L）与探针（10 μmol/L）反应，得到比率荧光图，其I483/I385的值随反应时间的变化如图2所示.由此可知，反应时间为30 min时，I483/I385值已基本不随水合肼浓度变化而变化，故选择30 min为适宜反应时间.

2.2.2 反应水相和有机相比例考察 从图示2的反应机理可知，探针与水合肼在偏酸性的环境中更容易发生反应，因为酸性太强会导致肼形成胺盐减弱亲和性，降低反应速率，本实验选择pH值为 3.8. DMSO本身显碱性，考察了醋酸缓冲液与DMSO体积比的影响，如图3所示，当其比值为4∶1时，荧光响应值最强.

2.3 选择性考察

对探针分子的选择性进行了考察，选取了部分可能产生干扰的阴离子（如：Br-， Cl-， HSO-3， I-和 SO2-4）以及部分金属阳离子（如： Mg2+， Cu2+， Hg2+， Zn2+， Pb2+， Ni2+， Fe3+， Cd2+， Ca2+， Ag+， Al3+和Mn2+）.通过实验得知，只有水合肼与探针发生特异性反应，引起荧光信号的变化，其他干扰离子均未与探针分子发生反应.该比率荧光探针与各类离子反应后I483/I385的值如图4所示，图中0和a为仅含探针的空白试样，由此可以推测，该探针对水合肼具有高度专一的选择性，可以用于水合肼的分析检测.

图4 探针（10 μmol/L）以及探针和各种离子（40 equiv）：1，hydrazine； 2， Mg2+； 3，Cu2+； 4，Hg2+； 5，Zn2+； 6，Pb2+； 7，Ni2+； 8，Fe3+； 9，Cd2+； 10，Ca2+； 11，Ag+； 12，Al3+； 13，Mn2+，b， hydrazine； c， Br-； d， Cl-； e， HSO3-； f， I-； g，SO2-4在pH=3.8的醋酸缓冲液和二甲基亚砜的混合体系中（4∶1，V/V）反应30 min后荧光I483/I385的值（λex=323 nm）

2.4 探针对水合肼荧光响应线性范围考察

在适宜反应时间（30 min）、醋酸缓冲液与DMSO体积比为4∶1时，利用该探针与不同浓度水合肼反应之后分别进行荧光检测，结果如图5所示.由图可知，反应产物的荧光在483 nm处的强度增加，385 nm处强度减弱，荧光强度的比率（I483/I385）与肼的浓度成线性关系.其响应线性方程为： F=0.13+0.085X （R=0.995），其中F为I483/I385的值；X为肼的浓度，线性相关系数为R.线性范围为：1～400 μmol/L 检测限为0.2 μmol/L.实验结果表明，本研究报道的荧光比率检测法线性范围宽，检测灵敏度高.

图5 探针分子（10 μmol/L）加入水合肼（0，0.1，1，2，4，6，10，20，30，40 equiv）后荧光强度的变化（λex=323 nm）

3 结论

设计并合成了一种以HBT为母体及乙酰丙酸为检测基团的比率荧光探针，可有效地排除因检测环境不同而带来的系统误差.该探针最大发射波长在385 nm处，当利用肼的亲核性与羰基先发生特异性反应成腙，然后环化消去保护基团乙酰丙酸，呈现HBT的荧光特性，荧光最大发射波长红移至483 nm.该探针水溶性好，检测范围宽，选择性好，快速高效，可用于实际样品中微量肼的分析检测.

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