TGF―β1、MMP―2、TIMP―2与子宫脱垂发生的相关性

【摘要】目的：检测盆腔器官脱垂（POP）患者子宫骶韧带组织中转化生长因子-β1（tgf-β1）、基质金属蛋白酶-2（mmp-2）、基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（timp-2）蛋白的表达；分析TGF-β1、MMP-2、TIMP-2各变量之间的相关性；阐明氧化应激可能是POP的发生发展的诱导因素。方法：Western blot检测POP和非POP正常患者子宫骶韧带组织中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达。分析TGF-β1、MMP-2、TIMP-2各变量之间的相关性。结果：Western blot技术检测结果显示，与非POP正常组相比，POP组子宫骶韧带组织中 TGF-β1及 TIMP-2蛋白表达水平下降，而MMP-2蛋白表达水平增加，使得MMP-2/TIMP-2比值增大，上述差异有统计学意义（P

【关键词】氧化应激；盆腔器官脱垂；转化生长因子-β1；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶组织抑制因子-2

Correlation of TGF-β1， MMP-2 and TIMP-2 and pelvic organ prolapseZHANG Xiaohong1， LIU Zhihong1， HONG Li2. 1.Department of Obstetrics and Gynecology， Hanchuan People’s Hospital， Xiaogan 431600， Hubei， China； 2.Department of GynecologyⅡ， Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060， Hubei， China

【Abstract】Objectives： To explore the effect of oxidative stress on the pathophysiology of pelvic organ prolapsed （POP）. Methods： The expression levels of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） and tissue inhibitors of metalloproteinase-2 （TIMP-2） of the samples were assessed by western blot analysis. Results： As revealed by western blot analysis， the expression levels of TGF-β1 and TIMP-2 were lower， while the MMP-2 expression was much higher in cardinal ligaments of POP group as compared with the control group， thus increasing the ratio of MMP-2/TIMP-2， with statistically significant differences （P

【Key words】Oxidative stress； Pelvic organ prolapse （POP）； Transforming growth factor-β1 （TGF-β1）； Matrix metalloproteinase-2 （MMP-2）； Tissue inhibitors of metalloproteinase-2 （TIMP-2）

【中图分类号】R711.74【文献标志码】A

盆腔器官脱垂（ pelvic organ prolapse， POP） 是由于盆底支持结构组织松弛或损伤致使盆腔脏器下垂，主要表现为阴道的前、后壁膨出、阴道穹窿脱垂或子宫脱出[1]。转化生长因子-β1（transforming growth factor-1，TGF-β1）是细胞外基质（extra cellularmatrix，ECM）的一种生物活性分子，与胶原代谢关系密切的细胞因子。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）可降解胶原，基质金属蛋白酶组织抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）可特异性与MMPs结合，抑制胶原降解。研究证实[2-6]机体在氧化损伤中产生ROS能够调节转化生长因子-β1，既可使成纤维细胞大量合成、分泌胶原蛋白，又可抑制ECM降解酶分泌，促进降解酶抑制剂的合成等方式调节ECM的代谢。基质金属蛋白酶抑制剂证实在氧化应激抗氧化的过程中是重要的抗氧化的蛋白酶抑制剂[7-9]。目前对POP分子学的研究主要是认为胶原的降解增多致使生物力学性能减弱而发病，是否由于生物力学的作用诱导了氧化应激还有待研究。本研究通过检测POP患者子宫骶韧带组织中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达，以阐明氧化应激在子宫脱垂发生的机制中的作用。

1材料与方法

1.1研究对象

选取2013年11月至2015年6月在湖北省汉川人民医院住院的病人，参照POP-Q评估分类系统的标准，患者诊断为Ⅲ或Ⅳ期盆腔器官脱垂，可伴或不伴压力性尿失禁，均进行的手术方式为阴式全子宫切除术和（或者）阴道的前和（或者）后壁修补术等一种或多种盆底手术24例患者为POP组，非盆腔器官脱垂的良性疾病患者而行阴式或腹式或腹腔镜全子宫切术20例患者为非POP正常组。应尽量减少对氧化应激水平有影响的混杂因素，故应排除患者与雌激素相关性疾病，如子宫内膜的增生、子宫肌瘤、内膜异位症的相关疾病、激素分泌性卵巢肿瘤，也要排除合并症的患者如恶性肿瘤、结缔组织疾病、糖尿病、心血管疾等均不被纳入，也要排除最近3个月内未使用任何激素及抗氧化类药物，手术后病理诊断为非功能性卵巢肿瘤等与雌激素相关性疾病的患者。两组间均无显著差异性（P > 0.05），具有可比性。

1.2组织来源

经汉川市人民医院伦理委员会批准后，纳入研究的所有患者均要签订知情同意书，选取术中患者切除子宫骶韧带组织0.5×0.5×0.2cm3，用无菌生理盐水简单清洗后迅速将组织放入含双抗（青霉素100kU/mL， 链霉素100mg/mL， 杭州吉诺生物有限公司）无血清DMEM培养基，为组织蛋白的提取用。

1.3方法

1.3.1组织蛋白的提取 ①取100mg 新鲜组织标本，眼科剪刀剔除干净后剪碎；②以1∶5比例，将1mg组织加入5mL裂解液的比例加入含PMSF的裂解液（1mL裂解液加入10μLPMSF），用超声器匀浆至充分的裂解；③裂解30min后，将裂解液移入1.5cm的离心管中，10000～14000g离心15min，取上清，-80℃保存。④整个组织裂解及离心过程均置4℃进行。

1.3.2蛋白质凝胶电泳①将玻璃板清洗干净后置放并晾干，对齐后紧卡在模具架中，同时也要垂直紧卡在架子上以备灌胶；② 配备12%分离胶，加TEMED和10%AP后立即摇匀后即行快速灌胶；③待水和胶间出现一条明显的折射线时，说明胶已凝固，即可弃去胶的上层液体；④配备4%浓缩胶，加TEMED和10%AP后快速来回混匀即行灌胶； ⑤所有蛋白样品调至等浓度后上样，操作轻柔避免吸入气泡，以避免上样不准确。

1.3.3蛋白转膜①将裁减好的NC膜置于超纯净水中充分浸泡大约20min后，再将其转移到缓冲液中浸润完全即可使用；②要先将蛋白凝胶电泳玻璃板的两端用吸水纸尽量吸干净，然后轻撬开玻璃板后，除去薄玻璃板并用其将浓缩胶弃去，注意勿使分离胶刮破。分离胶而后置于转移缓冲液浸泡15min，即行转膜；③恒流200mA，转膜2h；④转膜完成后，打开转移器，将膜轻取出，在室温下晾干备用。

1.3.4免疫反应①将电转好的膜用TBS清洗后，置放在5%脱脂牛奶中封闭，摇床lh；②TBS清洗膜3遍，置适当比例一抗溶液中并摇床上4℃过夜；③取出膜摇床0.5h，待其恢复到室温，收集一抗溶液，4℃保存，可以重复使用3～4次；④TBST清洗膜3遍，膜置放在适当比例生物素标记二抗溶液中，摇床lh；⑤〗TBST清洗膜3遍；⑥而后进行扫膜拍照，根据条带灰度分析系统定量，获取蛋白的表达。

1.4统计方法

将western blot条带转化为灰度值后，用SPASS13.0软件进行统计学分析，使用配对样本T检验比较POP组和非POP组间检测指标的差异（检验水准为α= 0.05），P

2结果

2.1POP组和非POP正常组组织中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白水平表达比较用Western Blot检测POP组与非POP组组织中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达，结果显示，POP组与非POP组比较， POP组组织中TGF-β1 和TIMP-2蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P

2.2POP组和非POP正常组组织TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达中变量之间相关关系POP组的组织中TGF-β1 与MMP-2蛋白的表达呈负相关关系（r=-0.463）而TGF-β1与TIMP-2蛋白的表达之间呈正相关关系（r=0.743），且相关均具有统计学意义（P0.05）。见图2。

3讨论

女性盆底是一个复杂支持系统，由肌肉群、筋膜、韧带及其神经等组织构成。女性盆底肌肉群、筋膜、韧带及其神经等组织构成盆底复杂的支持系统，支撑子宫、膀胱和直肠等盆腔脏器于正常位置，一旦脱离正常位置达一定程度，就表现POP。研究[10，11]发现盆底支持组织结构松弛是细胞外基质的胶原成分的改变所致，也成为了POP发生的主要原因。研究显示基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制因子及其调控其作用的转化生长因子-β1能够调节胶原代谢，TGF-β1也能够促进纤维蛋白及胶原表达而抑制ECM分解在ECM的合成调控中起重要作用[12，13 ]。

MMP-2（明胶酶A）主要作用底物是Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Ⅳ型胶原、弹性蛋白、纤维粘连蛋白等。而TIMP-2是MMP-2抑制剂。MMP-2活化在细胞表面进行，主要由体内的结缔组织细胞以非活性酶原形式分泌再进行活化，先由膜型基质降解酶（MT-MMP）发动，随后取决于MT-MMP和TIMP-2复合体的形成，这是与其它类MMPs家族成员作用的不同之处。首先，MMP-2 酶原结合于结缔组织细胞表面的MT-MMP/TIMP-2 复合体（受体）上，就构成了一个新的MT-MMP/TIMP-2/MMP-2 酶原三元复合体[33]。复合体形成后，才可使邻近游离MT-MMP 分子分解已固定的MMP-2酶原，再由无活性MMP-2变成中间状态的形式，而后自发水解释放出活性MMP-2，使得活化完成。因此，细胞内TIMP-2浓度对MT-MMP介导的MMP-2活化扮演着不可低估的作用。当TIMP-2过量时，可减少细胞内游离MT-MMP含量，其MMP-2酶原不能得到活化；而TIMP-2 量少时，导致细胞内游离的MT-MMP增加，MMP-2酶原活化得到增多。TIMP-2是与活化MMP -2以非共价形式结合，其结合以1∶1分子比例形成。机体在生理情况下，MMP -2和TIMP -2之间是维持动态平衡，使ECM沉积与降解之间平衡起重要的作用。而在某些病理状态下MMP -2和TIMP -2代谢异常致两者之间的动态平衡被打破，使胶原降解增加，进一步加重细胞外基质代谢失衡。氧化应激可能通过引起盆底支持组织中MMP -2和TIMP-2异常，导致其生物力学性能下降，参与POP的发生；而TGF-β1作为机体重要的MMP -2/TIMP-2的调控作用，也可能参与氧化应激对POP的调控。

实验结果显示，POP患者子宫旁韧带组织中TGF-β1和TIMP-2蛋白水平低于对照组且有显著差异性，POP组组织MMP-2蛋白水平高于非POP正常组，提示TGF-β1、MMP-2、TIMP-2可能参与POP的发生发展过程。

为了进一步分析TGF-β1、MMP-2、TIMP-2在POP中是如何起调控作用，对POP组和非POP正常组组织TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白水平的表达进行了相关性分析，发现非POP正常组组织TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达之间无明显相关性，POP组组织TGF-β1与MMP-2蛋白的表达呈负相关而与TIMP-2蛋白表达呈正相关，致使MMP-2/TIMP-2比例升高，继而两者动态平衡性破坏，使ECM分解增多，因此从相关性分析得出TGF-β1 对MMP-2/TIMP-2比例的影响是POP发生的关键。

研究[14-16]证实氧化应激可导致心、眼、肾、肺组织损伤及纤维化改变，发现TIMPs显著增高，与转化生长因子-β1有关。研究已表明氧化应激可能参与子宫脱垂的发生，如[17]POP患者盆底支持组织中抗氧化酶产物表达比非POP患者的组织中降低。

本研究证实POP患者子宫韧带中TGF-β1降低及调控的基质金属蛋白酶升高，提示TGF-β1与POP发生相关，并且是POP的保护因素。那么POP患者子宫旁韧带中TGF-β1及其调控代谢相关变化是否由氧化损伤所致，目前尚无文献报道。

本研究说明可能机械力激活ROS，从而使TGF-β1下调，使MMP-2/TIMP-2比例的发生改变，参入了POP的发生。

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