复肝宁对免疫性肝纤维化大鼠HYP SOD MDA的影响

摘 要：目的：通过大鼠肝纤维化动物模型，研究中药复方复肝宁治疗肝纤维化的效果及部分作用机制。方法：采用猪血清诱导免疫性肝纤维化动物模型。70只大鼠随机分6组：正常组，模型组，秋水仙碱治疗组，复肝宁低、中、高剂量治疗组。造模6周后，各组大鼠给予相应的药物或生理盐水灌胃。实验第10周末，处死动物，并采集肝组织标本。测定肝组织羟脯氨酸(HYP)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，通过光镜观察肝病理组织学改变。结果：与正常组比较，模型组大鼠肝组织HYP含量明显升高(P

关键词：复肝宁；肝纤维化；实验研究

中图分类号：R-33

文献标识码：A文章编号：

1673-7717（2008）11-2492-03

Effects of FuGanNing on Serum HYP SOD and MDA in Rats with Immune Hepatic Fibrosis

WANG Xiaoping1 ,ZHOU Yuping2

（1.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong,China;

2.Gansu College of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China）

Abstract：Objective:To study the therapeutic effect and mechanism of FuGanNing on rat with immune hepatic fibrosis induced by porcine serum injection.Methods:The immune hepatic fibrosis model was induced intraperitoneal injection of porcine serum. Seventy Wistar rats were randomly divided into six groups: normal group, model group, colchincines group, low, middle and high dose FuGanNing groups. After 6 weeks, all rats were given medicine via gastrogavage respectively. At the end of 10th weeks, all rats were sacrificed. The serum levels of hydroxyproline (HYP) content, malondial dehyde (MDA) content, superoxide disumutase (SOD) activity of liver tissue were measured respectively. The histological changes of liver tissue were observed with optic microscope.Results: Compared with normal group, the content HYP of the model group were significantly increased (P

Key words：FuGanNing; hepatic fibrosis; experimental study

肝纤维化（Hepatic fibrosis，HF）是临床常见的病证之一，是大多数慢性肝病所共有的病理特征，也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展、恶化的重要中间环节。祖国医学因其独特的辨证论治理论体系和丰富的临床经验，在防治HF已取得了确切疗效，中药复方和单味药及其有效成分因具有良好的抗肝纤维化作用，其中尤以复方中药抗肝纤维化所显示出的多层次、多途径、多环节、多靶点综合药理学作用更为引人注目，展现了中医药抗肝纤维化的广阔前景。本次研究所用中药复方复肝宁是以中医学理论为指导，结合周语平教授多年的临床经验组方而成。为进一步探讨该方治疗肝纤维化的作用及机制，为临床应用提供现代科学实验依据，也为以后研发新药打下基础，笔者进行了实验研究。

1材料与方法

1.1 材料动物：SPF级Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重（200±20）ｇ。药品：复肝宁：由丹参、桃仁、当归、黄芪、苦参、汉防己、柴胡等药组成，黄芪、当归水煎浓缩，其余中药做水提醇沉处理，2次药液混合，相当于原生药1.54g/mL，备用。秋水仙碱片：昆明制药集团股份有限公司生产，生产批号：20031149。研成粉末，临用时用无菌生理盐水配成浓度为10mg/mL的混悬液，备用。试剂：猪血清：中美合资民海生物工程有限公司，生产批号：20041122，低温冰箱储存。HYP、SOD、MDA、考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒：南京建成生物制品所，生产批号：20051102，20051102，20051026，20051104。主要仪器：BS110电子分析秤、Primo生化离心机、UV-120-02紫外分光光度仪、Olympus系统显微镜。实验条件：动物在甘肃中医学院动物实验中心（SPF级）实验室分笼饲养，室温保持在20～24℃，相对湿度40%。用无菌处理的普通饲料喂养，自由饮用无菌水。

1.2方法动物适应1周后按体重编号，依据随机数字表法分为6组：正常组、模型组、秋水仙碱治疗组、复肝宁低、中、高剂量治疗组。正常组10只，其余各组均为12只，雌雄各半。实验选用猪血清诱导免疫损伤性HF模型。除正常组外，其余各组均参照于世瀛等[1]的方法制造HF病理模型，采用未灭活猪血清腹腔注射，每周2次，每次0.5mL/只，连续10周。6周后即可形成HF。各治疗组于造模6周后给药，1次/日，每天同一时间灌胃，连续4周，分别根据大鼠具体体重确定药量，每3~4日称体重量后调整剂量1次。用药剂量：复肝宁低、中、高剂量治疗组分别按3.85、7.70、15.40g/kg灌胃治疗；秋水仙碱治疗组按0.1mg/kg体重灌胃给药；模型组和正常组每日予蒸馏水灌胃1次，2mL/次。实验10周后结束，均于末次给药后24h，禁食12h，动物断颈处死。肝组织匀浆制备：取右叶部分肝组织，用冰生理盐水冲洗，冰浴中制成10%肝组织匀浆，离心3000r/min×10min，待测。肝组织制备：光镜：取右侧肝叶，用10%中尔马林液固定，石蜡包埋和HE染色。

1.3 观察指标及方法肝组织HYP含量、SOD活力、MDA含量测定：均应用比色法测定，按试剂盒说明书操作，其中HYP含量用μg/g表示，SOD含量用表示U/mg，MDA含量用nmol/mg表示。肝组织形态学：肝组织经梯度酒精系列脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、HE染色、观察肝脏组织学改变并照相。肝纤维化分级参照文献分为4级：“-”汇管区无明显纤维组织；“+”汇管区有较多的纤维组织，局限性；“+ +”汇管区有大量纤维组织增生，呈窄带状，并向肝小叶周围伸展；“+ + +”汇管区有大量纤维组织增生，呈宽带状，并伸展包绕肝小叶，且可见中央静脉偏位。

1.4 统计处理计量资料采用单因素方差分析，两两作Tukey-t检验，用均数±标准差（±s）表示；等级资料各组间比较采用非参数秩和检验。P值

2结 果

2.1 各组大鼠肝组织HYP含量的变化 从表1可见，猪血清所致大鼠慢性肝损伤引起组织中HYP含量显著增高，提示HF模型形成。与空白组相比较，模型组中HYP含量显著升高(P

2.2各组大鼠肝组织SOD MDA的变化 见表2。

从表2可见，与空白组相比较，模型组中SOD活力显著下降(P

2.3 病理形态学观察 正常组：肝组织由无数个肝小叶组成，肝小叶中央为中央静脉，肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射状排列，板间有不规则肝窦，仅于汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型组：多数正常小叶结构破坏或消失，肝脏广泛纤维组织增生，尤以汇管区为重，同时向肝小叶内增生，将肝小叶分割包绕形成大小不等的假小叶，假小叶内肝细胞变性，肝细胞索排列紊乱，中央静脉周围肝细胞肿胀明显，肝细胞浆中可见较多大小不等空泡，肝窦受压，中央静脉偏位或缺如，增生的纤维间有较多的炎性细胞浸润。各药物治疗组：与模型组比较，肝小叶结构改善明显，多呈放射状分布，汇管区纤维组织增生显著减少，纤维条索疏松变窄，纤维间隔显著变薄、减少，肝细胞坏死，炎性细胞浸润少见，病理损伤有不同程度的减轻，且尤以高剂量组明显。各组大鼠肝纤维化程度分级具体情况见表3。

从表3可见，模型组HF程度显著高于正常组(P

3讨论

中国人群发生HF的主要原因是病毒性肝炎，笔者认为HF多属嗜酒好醴者或情志抑郁者，素常饮食不洁或常怀愤郁之气，正气内应，外感湿热疫毒之邪，邪毒阻滞肝经，气滞血瘀，继则肝病传脾，脾失健运，肝脾不和，脏腑机能失调，气血结而不畅，血脉失养，久而酿成积之根。本病病程较长，进展缓慢，邪毒久羁不除，日久逐渐耗伤正气，终致正虚邪恋，本虚标实之证。根据慢性肝炎肝纤维化的病因病机，结合临床经验，周语平教授提出以活血化瘀、益气健脾为主，兼清热利湿、疏肝解郁的治法，并自创新方复肝宁，用于治疗慢性肝炎肝纤维化以瘀血阻滞肝脉、脾气虚弱为主，兼见湿热未尽、肝郁气滞为主要病机的患者，疗效显著。根据现代药理学研究表明，复肝宁中多味中药被公认为具有保护肝细胞，改善肝脏微循环，促进肝功能恢复，调节免疫，促进肝细胞再生等功能，符合中药多途径、多环节、多靶点发挥抗HF作用。

目前已公认HSC是HF时ECM过多产生和沉积的主要细胞来源，它的激活和增生在HF过程中起主要作用[2-3]。氧化应激及氧自由基触发的脂质过氧化是导致肝细胞损伤及激发HSC活化、胶原基因表达的重要机制[4-5]。活性氧、超氧阴离子在体内产生的自由基通过脂质过氧化作用损伤、破坏肝细胞，产生脂质过氧化物，促进HSC合成胶原，并通过激活KC释放细胞因子，刺激HSC转化、增殖、合成ECM，同时抑制ECM降解，导致HF形成[6]。MDA为脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死，其含量反映了组织过氧化损伤的程度。SOD则具有清除氧自由基的作用，肝脏病变时其解毒功能降低，缺血、缺氧，即可引起SOD合成减少，导致氧自由基增多[7]。因此，抑制脂质过氧化则是抗HF的重要环节。

本实验结果表明，与模型组比较，经复肝宁治疗后，高、中剂量组大鼠肝组织SOD活性升高，MDA含量则降低，且以高剂量组效果更明显(P

参考文献

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