抗毒扶正1\2号方提取液体外抗SRS病毒细胞活性作用

（上海中医药大学，上海 201203）

摘 要：目的： 探讨抗毒扶正1、2号方提取液对SRS病毒细胞增殖的抑制作用，为艾滋病临床治疗提供实验依据。方法： 将抗毒扶正1、2号方提取液倍比稀释若干浓度，加入SRS细胞体系。以［3H］-TdR掺入法和RT-PCR法观测抗毒扶正1、2号方提取液对SRS细胞增殖的影响。结果： 抗毒扶正1、2号方提取液组cpm值均较阴性对照组有所降低，SRSmRNA表达较阴性对照组有所降低。结论：抗毒扶正1、2号方提取液均有抑制SRS病毒细胞增殖的作用，且随药物浓度的升高，抑制作用也逐渐增强。提示抗毒扶正1、2号方对SRS病毒细胞具杀伤作用，对艾滋病临床治疗中药抗毒扶正方的筛选具实用价值。

关键词：抗毒扶正；［3H］-TdR掺入法；细胞增殖；温病

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717（2011）03-0566-03

Experimental Study on the Activity of SRS Virus Cell Intervened by

Antitoxic and Fuzheng 1,2 Recipe Extract in Vitro

TU Yan-jie,GUO Yong-jie,YANG Ai-dong,YANG Yang,WU Zhong-hua,WANG Shuang

（Shanghai University of TCM,Shanghai 201203,China）

Abstract:Objective：To approach the effect of Antitoxic and Fuzheng 1,2 recipe extracts on SRS cell's proliferation ，which is in order to provide scientific base for TCM screening in Clinical treatment of AIDS. Methods：Antitoxic and Fuzheng 1,2 recipe extracts are diluted into different concentrations and added into the SRS virus cell. The SRS cell's proliferated suppression ratio are detected by ［3H］-TdR incorporation method, and SRS virus's mRNA express are determined by RT-PCR method. Results：The cpm value and the SRS virus's mRNA express in antitoxic and Fuzheng 1,2 recipe extracts are lower than the natural control group. Conclusions：Antitoxic and Fuzheng 1,2 recipe extracts both have the inhibiting effect on the SRS virus cell's proliferation.With the raise up of drug concentration,the inhibiting effect are raise up too.

Key words:Antitoxic and Fuzheng;［3H］-TdR incorporation;cell's proliferation；warm diseases

收稿日期：2010-10-25

基金项目：上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金项目［沪教委人（2007）68号］

作者简介：屠燕捷（1980-），女，河北秦皇岛人，讲师，硕士，研究方向：温病学教学和研究。

艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）感染所导致的一种严重威胁人类生命健康的传染病。据联合国艾滋病规划署的《2009年全球艾滋病流行报告》显示，目前全球共有约3340万HIV感染者，2008年新增感染者约270万，而有约200万人死于艾滋病。令人欣慰的是，艾滋病相关疾病的死亡人数在过去五年里下降了10%以上。其中，中国利用中医治疗优势在扩大预防和治疗艾滋病方面取得了显著进展［1-2］。

中医治疗具有辨证施治的优势，可根据患者的自身体质和症状表现采用个体化治疗，且中药性质相对平和，毒副作用较小，依从性好，可通过调节机体免疫系统，改善患者的症状体征，提高其生活质量，延长带毒生存时间。人们尤其寄希望于中医药在感染HIV病毒后的无症状期发挥积极作用。

本实验旨在探讨抗毒扶正1、2号方提取液对SRS -BⅡMuLV细胞活性的作用及其可能机制，为艾滋病临床治疗中药扶正方剂的筛选提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SRS-BⅡ淋巴瘤细胞株由复旦大学医学院生理病理教研室提供。抗毒扶正1号方由西洋参、紫草、生甘草等中药按一定比例组成。抗毒扶正2号方由生晒参、丹参、生甘草等中药按一定比例组成。两方均购自上海蔡同德堂。齐多夫定由东北制药总厂生产（批号为20070201）。

1.2 方法

1.2.1 药液的制备与稀释 将抗毒扶正1号方、抗毒扶正2号方分别经蒸馏水浸泡后，煎2次，合并煎液，除渣过滤，用双蒸水稀释至5mg/mL（生药）水提液，高温高压灭菌。两方药液各取1/2量经0.45nm滤膜过滤处理。将处方量的阳性对照药物齐多夫定加蒸馏水，于45℃水浴中搅拌至溶解，经0.45nm滤膜过滤除菌处理。

1.2.2 ［3H］-TdR掺入法测定抗毒扶正1、2号方提取液对SRS病毒细胞增殖的抑制率 将生长良好的SRS病毒细胞浓度稀释为1.5×106/mL，接种入96孔培养板中， 100μL/孔［3］。将过滤与非过滤的4种中药提取液及齐多夫定药液用DMEM培养液稀释后加入96孔板中，分别配制成为100、20、4、0.8、0.16μg/mL5个浓度，阴性对照组加入100μL含10%血清的培养液。每孔体积均为200μL。设3个复孔［4］。于含5% CO2的37℃培养箱中培养48h，培养结束前12h， 每孔加入25μL［3H］-胸腺嘧啶核苷酸（1.9×104Bq）。继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta 记数仪（MicroBeta Trilux, PerkinElmer Life Sciences）上读取掺入细胞DNA 的［3H］-胸腺嘧啶核苷量，以cpm 值代表细胞增殖的情况，以下列公式计算样品对SRS病毒细胞的抑制率：细胞抑制率（1-各组cpm值/阴性对照组cpm值）×100%。实验重复3次。

1.2.3RT-PCR法检测抗毒扶正1、2号方提取液干预下SRS病毒mRNA表达 将抗毒扶正1、2号方提取液分别设置100、20、4μg/mL 3个浓度。齐多夫定取100μg/mL。将SRS病毒细胞接种入96孔板，每孔100μL，加入100μL不同浓度的抗毒扶正1、2号方提取液，阳性对照组加入100μL齐多夫定，阴性对照组加入100μL的DMEM培养液，使各孔总体积为200μL。细胞于含5% CO2的37℃培养箱中培养48h取出，用RT-PCR法（reverse tran scription）测定SRS病毒mRNA。SRS上游引物为：5’-GAGACTGTTGGACCAGGGAA -3’，下游引物为：5’-TTGTCCTGAGATTCCCAT -3’。β-actin上游引物：5’-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，下游引物：5’-ATGTCACGCACGATTTCC-3’（由上海英俊生物技术有限公司合成）。经凝胶成像分析系统摄像，扫描PCR产物强度。以SRS密度值/β-actin密度值作为各孔细胞SRS-mRNA的相对含量。

1.2.4 统计学处理 所有数据均以 ±s表示，应用SPSS 17.0软件进行统计学处理。经正态分布检验符合正态分布，采用组间均数两两比较的方差分析和T检验判定组间差异显著性。以P

2 结 果

2.1 抗毒扶正1、2号方提取液对SRS病毒细胞增殖的抑制作用测定结果

见表1～2，图1。

表1 ［3H］-TdR掺入法测定抗毒扶正1、2方中药提取液对SRS病毒细胞作用cpm值

注：不同浓度药物组与细胞对照组比较，*P

对SRS病毒细胞增殖抑制率

抗毒扶正1、2号方提取液组和齐多夫定组cpm值均较阴性细胞对照组有所降低。

各抗毒扶正方组与阳性对照药物组结果比较显示：最高浓度（100μg/mL）抗毒扶正1号未过滤组cpm值较同浓度阳性对照组低，差异具显著性意义，而低浓度（0.8、0.16μg/mL）抗毒扶正1号未过滤组cpm值较同浓度阳性对照组高，差异也具有显著性意义。除最高浓度（100μg/mL）外，各浓度抗毒扶正1号过滤组和抗毒扶正2号未过滤组cpm值均较同浓度阳性对照组高，差异具有显著性意义。中、低浓度（4 、0.8、0.16μg/mL）的抗毒扶正2号过滤组cpm值较同浓度阳性对照组高，差异具有显著性意义。

同种抗毒扶正方过滤组与未过滤组结果比较显示：高浓度（100、20μg/mL）抗毒扶正1号过滤组cpm值比未过滤组cpm值有所升高，差异具有显著性意义。最高浓度（100μg/mL）抗毒扶正2号过滤组cpm值较同浓度未过滤组升高，差异具有显著性意义。

抗毒扶正1号方组与抗毒扶正2号方组结果比较显示：高浓度（100、20μg/mL）抗毒扶正2号方未过滤组cpm值较同浓度抗毒扶正1号方未过滤组cpm值高，差异具显著性意义。

2.2 抗毒扶正1、2号方提取液对SRS病毒 mRNA表达的影响

PCR产物凝胶电泳结果显示，抗毒扶正1号方100、20、4μg/mL3个浓度组和抗毒扶正2号方100μg/mL组条带相比阴性对照组较暗。

定量分析显示，100、20和4μg/mL的抗毒扶正1号方、100μg/mL的抗毒正2号方干预下的SRS病毒细胞mRNA表达较阴性对照细胞mRNA表达有所降低，见图2、表3。

注： 1：Marker； 2：阴性对照组； 3：阳性对照组；4：抗毒扶正1号方100μg/mL组； 5：抗毒扶正1号方20μg/mL组； 6：抗毒扶正1号方4μg/mL组； 7：抗毒扶正2号方100μg/mL组； 8：抗毒扶正2号方20μg/mL组； 9：抗毒扶正2号方4μg/mL组。Marker大小说明：从上至下依次为1000Bp、900Bp、800Bp…100Bp。

图2 不同浓度的抗毒扶正1、2号方中药提取液及

齐多夫定干预下的SRS mRNA表达

表3 不同浓度的抗毒扶正1、2号方中药提取液对SRS

mRNA表达的影响

3 讨 论

近30年来，中医学研究者在艾滋病体外细胞实验研究和中药干预艾滋病的动物实验研究方面做了大量工作，发现了六七十种具有不同程度地抑制HIV病毒作用的中草药及复方，并从一系列中药中提取出对HIV具抑制作用的有效成分。但由于HIV病毒的致病性强，危害程度高，一定程度上，艾滋病中医实验研究的可操作范围受到限制。本实验选用与HIV病毒同属逆转录病毒科的SRS -BⅡMuLV病毒细胞株替代HIV，在生物安全1级实验室环境即可进行病毒细胞培养实验［5］。

本实验所选抗毒扶正1、2号方分别根据中医温病学说中温毒伤气、温毒伤阴理论制定而成。中医认为，人体感受艾滋病疫毒浊邪后，由于正气强弱不同，邪毒或潜伏于三焦膜原，渐损气血；或引发急性感染征候群，疫毒之邪流布三焦，肆虐于机体，卫气营血俱受其累，伤阴耗精，出现痰、瘀、湿、毒等病理产物，日久形成虚实夹杂、本虚标实之证，最后阴涸液竭，阳气衰脱而不治身亡。［6］ 无论其病潜伏期或发病期，均具有气血不足、气阴两亏、瘀血内停的病理特点，治疗需以扶正活血解毒为主。［7］

抗毒扶正1号方由西洋参、紫草、生甘草等中药组成，全方意在清热解毒，益气养阴，兼以凉血，攻补兼施。实验研究证明，方中西洋参可提高机体免疫力，对缓解艾滋病所出现的肺虚久咳、口咽干燥、心烦失眠、四肢倦怠、失血气短等症状有一定疗效；紫草中含有的紫草素能抑制对H9细胞系中HIV有抑制作用；甘草具有诱导干扰素，能增强NK细胞的功能，对HIV有抑制作用［8］。其组方对艾滋病潜伏期或发病期缓解症状具实用意义。

抗毒扶正2号方由生晒参、丹参、生甘草等中药组成，全方意在益气、活血化瘀，兼以解毒。艾滋病患者在患病期间均会出现不同程度地瘀血之证，如面色晦滞，皮下瘀血，舌质紫暗，脉象沉涩等，活血通瘀是重要治疗环节，我们认为，解毒活血的治疗理念应贯穿于艾滋病治疗的全过程。方中所用丹参可加强心肌收缩而不增加心肌耗氧，扩张冠状动脉，使冠脉血流量增加，并有抗血栓形成和改善血液流变学的效果［9］ 。

从SRS病毒细胞体外实验结果分析，不同浓度的抗毒扶正1、2号方提取液均有一定程度地抑制SRS病毒细胞增殖的作用，且随着浓度升高，抑制作用增强。除最高浓度下未过滤的抗毒扶正1号方对SRS病毒细胞增殖的抑制作用较同浓度齐多夫定强外，其余浓度下抗毒扶正1、2号方对SRS病毒细胞增殖的抑制效果均与同浓度齐多夫定无明显差异或弱于齐多夫定，提示抗毒扶正1、2号方对SRS病毒细胞的杀伤作用与齐多夫定相似，且并无明显优势，两方对艾滋病的治疗或从其他角度如调动机体免疫机能等方面发挥作用。高浓度未经过滤的抗毒扶正方表现出较过滤的抗毒扶正方更好地对SRS病毒细胞增殖的抑制作用，可能与抗毒扶正方中含有对抗HIV有效的大分子成分作用相关。在未经过滤的情况下，高浓度的抗毒扶正1号方对细胞增殖的抑制作用强于同浓度抗毒扶正2号方，也为评价中药对艾滋病的疗效以及进一步艾滋病动物实验研究的方药筛选提供了依据。

参考文献

［1］ 联合国艾滋病规划署. 2009年全球艾滋病流行报告［C］. 2009.

［2］ Troy Brady, Luis M. Agosto, Nirav Malani.HIV integration site distributions in resting andactivated CD4R T cells infected in culture［J］.AIDS，2009, 23：1-11

［3］ 张卓然.培养细胞学与细胞培养计数［M］.上海：上海科学技术出版社,2004:316.

［4］ 王敏，傅雷，江励华，等.加减清营汤对H2O2损伤的血管内皮细胞存活率和SOD活力的影响［J］.中华中医药学刊,2008，26（1）：141-143.

［5］ 中华人民共和国卫生部制定.人间传染的病原微生物名录［M］.2006.

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［8］ 肖明中.甘草的药理作用及其用于艾滋病的研究进展［J］.湖北中医杂志，2006，28（12）：48-50.

［9］ 刘占国.丹参注射液在艾滋病肺部感染中的应用［J］.河南中医学院学报，2008，23（138）：4-5.