miR—106b对宫颈癌SiHa细胞运动侵袭功能的影响

[摘要] 目的 研究mir-106b对宫颈癌siha细胞转移侵袭功能的影响及作用机制。方法 SiHa细胞转染miR-106b inhibitors和mimics，实时定量PCR检测转染效率，Transwell及划痕法检测细胞运动侵袭功能，分析E-cadherin、PTEN、p-AKT（Ser473）蛋白表达情况。 结果 miR-106b inhibitors和mimics改变SiHa细胞中miR-106b表达。转染miR-106b inhibitors后，细胞迁移数、移动距离减少（P

[关键词] miR-106b；宫颈癌；转移；PTEN；E-cadherin

[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0009-03

宫颈癌是女性第三大恶性肿瘤[1]，尽管人瘤病毒（HPV）疫苗、手术、放疗、化疗等综合手段用于预防及治疗宫颈癌，但许多患者最终死于肿瘤的复发与转移。MicroRNA（miRNA）是一种只有21～25个碱基的非编码小RNA，它可以通过降解mRNA和（或）抑制翻译，于转录后水平调节靶蛋白的表达，发挥多种生物学功能，包括对肿瘤细胞转移侵袭恶性表型的影响[2-3]。有研究显示miR-143、miR-205、miR-106b等多种miRNA在宫颈癌中表达失调[4-6]。miR-106b在结肠癌、头颈部鳞癌、食管癌中高表达，并影响它们的转移侵袭等功能[7-9]。尽管其在宫颈癌组织中高表达，且其表达受HPV的E6、E7的调节[10]，但其对宫颈癌的生物学行为的影响目前未见报道，因此本文旨在研究其对宫颈癌细胞转移侵袭功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌细胞SiHa购自美国ATTC。DMEM培养基购自美国Gibco公司。脂质体2000购自美国Life Technologies公司。Matrigel购自美国BD Co.公司。Transwell小室购自美国Costar，Corning Inc.公司。miR-106b inhibitors、mimics以及阴性对照购自美国Dharmacon公司。E-cadherin、PTEN、p-AKT（Ser473）、β-actin购自美国Santa Cruz公司。Trizol购自美国Invitrogen公司。miR-106b反转录引物及实时定量PCR扩增引物、反转录试剂盒、TaqMan MicroRNA试剂盒、U6 snRNA 购自广州锐博公司。

1.2 miR-106b inhibitors、mimics转染SiHa细胞

将SiHa细胞接种于6孔板中。按照脂质体2000说明书进行miR-106b inhibitors、mimics的转染，实验组命名为106b inhibitor和106b mimic，并设置阴性对照（inhibitor NC和106b mimic NC）、空白对照（blank，即未转染的SiHa细胞）。转染6 h后换新培养基，继续培养24 h，用于后续试验。Real-time PCR检测转染效率。

1.3 Real-time PCR

应用Trizol抽提总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，应用TaqMan MicroRNA试剂盒对cDNA进行实时定量PCR反应，反应条件：95℃ 1 min 变性，95℃ 15 s，60℃ 20 s，70℃15 s，40循环，U6为内参照。每一实验重复3次。

1.4 Transwell实验

转染24 h后细胞进行Transwell实验。小室的上室铺Matrigel 50 μL，凝固后小室的上室加入含2×105细胞的100 μL培养液（不含血清），下室加入10%胎牛血清DMEM培养液0.5 ml，置孵箱培养24 h。取出膜，拭去膜上层细胞，甲醇固定，苏木精染色，高倍镜下计数穿膜细胞数。取3个不同视野计数，重复3次实验。

1.5划痕实验

转染24 h后细胞达95%融合度时，用小移液器滴头划痕。PBS洗3次。标记，改用无血清DMEM培养，Nikon倒置显微镜镜下记录划痕宽度并拍照。24 h后观察划痕愈合情况。重复3次实验。

1.6 Western blot实验

收获各组细胞，加入100 μl，4℃的细胞裂解液裂解，于10 000×g 4℃下离心10 min。Bicinchoninic acid法测定蛋白浓度。取100 μg总蛋白进行电泳，转膜（PVDF膜）；5%脱脂奶37℃封闭1 h，加入E-cadherin（1∶500）、PTEN（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、β-actin（1∶1000）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入相应的二抗，常温孵育1 h，最后NBT/BCIP显色拍照。蛋白条带以β-actin为参照，利用灰度分析法测其相对蛋白含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件，各组数据均采用x±s表示，行t检验或ANOVA分析，以P

2 结果

2.1 miR-106b inhibitors、mimics转染效率的检测

miR-106b inhibitors抑制细胞中miR-106b的表达，与阴性对照组相比miR-106b表达下降约3倍（0.32±0.03）（P

2.2 Transwell实验

blank、mimics NC、106b mimics、inhibitor NC、miR-106b inhibitor组迁移细胞数分别为66.26±6.63、70.26±7.31、126.58±8.33、62.48±6.72、38.72±4.33。细胞转染miR-106b mimics后，其侵袭能力明显增强；转染miR-106b inhibitors后，其侵袭能力受到明显抑制（P0.05）。

2.3 划痕实验

blank、mimics NC、106b mimics、inhibitor NC、miR-106b inhibitor组细胞移动距离分别为：（52.31±4.97）、（51.37±5.85）、（94.00±7.94）、（52.73±4.11）、（31.06±3.54）μm。细胞转染miR-106b mimics后，其运动能力明显增强；细胞转染miR-106b inhibitors后，其运动能力受到明显抑制（P0.05）。

2.4 Western blot检测

细胞在转染miR-106b inhibitors后p-AKT表达受到抑制，下降约2倍（阴性对照vs实验组为0.87±0.07 vs 0.42±0.03，下同），E-cadherin、PTEN表达增强约2倍（前者为0.17±0.02 vs 0.38±0.03，后者为0.48±0.05 vs 0.95±0.04）；转染miR-106b mimics后，情况相反，即p-AKT表达增强约2倍（0.80±0.04 vs 1.52±0.06），E-cadherin表达几乎测不出，PTEN表达下降约2倍（0.49±0.03 vs 0.21±0.02）（P

3讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要标志，临床中约90%以上的患者死于肿瘤侵袭转移[11]。因此，对肿瘤转移发生发展的分子机制进行研究尤为重要。miR-106b编码基因定位于染色体7q22.1，在宫颈癌中高表达，其表达还受HPV的E6、E7蛋白的调节，而HPV是宫颈癌的致病因素[12]，因此推测其在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。本研究显示，miR-106b对宫颈癌细胞SiHa的转移侵袭表型具有促进作用。当转染miR-106b的inhibitors及mimics后，运用划痕及Transwell实验检测细胞运动侵袭功能时发现，其在宫颈癌细胞中的表达降低，能抑制宫颈癌细胞的转移侵袭，增强其表达时，作用相反。

本研究进一步检验了改变宫颈癌细胞中miR-106b的表达时，E-cadherin、PTEN、p-AKT蛋白的表达情况。根据TargetScan、Pictar及Mirnada等数据库预测，PTEN有可能是miR-106b直接作用的靶基因，PTEN是一个重要的抑癌基因，其在许多肿瘤中表达减弱、缺失或突变。当其表达降低时，能促进肿瘤细胞对化疗药物的耐药及侵袭转移功能，而增强表达时，对肿瘤的恶有抑制作用[13]。p-AKT是PTEN基因下游调节网络的节点——蛋白激酶B（AKT）的磷酸化形式，其可以促进细胞存活及侵袭运动功能[14]。本研究显示，当降低miR-106b的表达时，SiHa细胞中PTEN表达增强；而当增强miR-106b的表达时，SiHa细胞中PTEN表达下降。因此可以推测，miR-106b有可能通过改变PTEN/AKT通路，影响细胞的转移侵袭功能。

E-cadherin是一个重要的黏附分子，其对维持细胞形态、细胞运动及黏附功能具有重要作用。相对于正常组织，其在大多数肿瘤组织（如结肠、卵巢癌、宫颈癌）中显示低表达、不均匀性表达，甚至显示表达阙如，并且表达强度往往随着肿瘤分化程度的下降而下降。有研究显示在乳腺癌细胞MCF-7中E-cadherin表达上调，抑制细胞的侵袭转移[15]；当胰腺癌细胞中E-cadherin表达下调时，细胞的侵袭功能增强[16]。E-cadherin能够通过EGFR激活PI3K/AKT信号通路，从而发挥其生物学功能[17]。本实验显示，当降低miR-106b的表达时，SiHa细胞中E-cadherin表达增强；而当增强miR-106b的表达时，SiHa细胞中E-cadherin表达几乎消失。据此可以推测，miR-106b有可能通过改变E-cadherin/AKT通路，影响细胞的转移侵袭功能。

综上所述，miR-106b在宫颈癌中高表达，其可能通过影响PTEN/AKT信号通路及E-cadherin/AKT通路，促进SiHa细胞转移侵袭，这将为临床诊治宫颈癌及判断预后提供新的思路和作用靶点。

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（收稿日期：2013-07-03 本文编辑：魏玉坡）