不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响

作者：赵继敏，金戈，黄幼田，杨洪艳，郑智敏，董子明

【关键词】 流式细胞术

Effect of wildtype and mutant DNA polymerase β expression on CHO cells growth

【Abstract】 AIM: To study the effects of the DNA polymerase β (DNA polβ) of wild type and the mutant（58 bp deletion） on Chinese hamster ovary cells (CHO). METHODS: The expression of mRNA of wild type and the mutant in transfectant cells was determined by RTPCR and the growth curve of transfected CHO cells was drawn with the MTT assay. The changes in cell cycle were analyzed by flow cytometry. RESULTS: Cell lines stably expressing wildtype and the mutational polβ were established. The CHO cells transfacted by the mutant gene were higher than untransfacted CHO cells in the growth rate of CHO cells and the percentage of S phase cells in vitro (P<0.05). The effects of the wildtype enzyme on growth rate and cell cycle were not observed（P>0.05）. CONCLUSION: The wild type and the mutant have different effect on CHO cells.

【Keywords】 DNA polβ; transfection; CHO cells; RTPCR; flow cytometry

【摘要】 目的：比较野生型和突变型（58 bp缺失）DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响. 方法：将表达人野生型和缺失型DNA polβ的中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），用RTPCR方法鉴定野生型和缺失型DNA polβ mRNA水平的表达，MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期. 结果：转染野生型和突变型DNA polβ的CHO细胞株中，都有外源基因mRNA水平的表达; 转染突变型（58 bp缺失）polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞，差异有统计学意义(P<0.05). 而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响（P>0.05）. 结论：高表达外源性野生型和突变型DNA polβ，对CHO细胞生长具有不同的影响.

【关键词】 DNA polβ; 转染; CHO细胞; RTPCR; 流式细胞术

0引言

碱基切除修复（base excision repaire, BER）是清除细胞内DNA损伤的主要途径，DNA聚合酶β（DNA polymerase β，DNA polβ）是BER过程中的关键酶. 研究polβ基因的突变及功能异常在肿瘤发生发展中的作用，对进一步阐明肿瘤的分子发病机制,对肿瘤的基因治疗有重要意义. 我们将不同类型的polβ的真核表达载体转染哺乳动物细胞，观察野生型和突变型polβ基因的表达对细胞生物学特性的影响如下.

1材料和方法

1.1材料

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)由陈萍萍博士惠赠, DMEM培养基为Hyclone公司产品, Trizol总RNA提取试剂盒为Gibco公司产品. CHO细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基、50 mL/L CO2, 37℃, 饱和湿润空气中培养.

1.2方法

1.2.1表达产物的mRNA水平的鉴定按Trizol试剂盒操作说明，分别提取野生型和突变型polβ转染和空载体转染的CHO细胞及未转染CHO细胞总RNA. 紫外分光光度计测定其浓度. 逆转录反应体系总体积为30 μL,反应体系中含1 mmol/L dNTP, 2.5 μmol/L随机引物，166.7 nkat RNA酶抑制剂，250.05 nkat AMV逆转录酶，1×逆转录反应缓冲液积5 mmol/L MgCl2,取总RNA 2 μg. 逆转录反应条件为42℃ 60 min,95℃变性5 min. 当鉴定目的基因在mRNA水平的表达时，RTPCR中我们采用了特异性较强的引物，利用质粒中T7启动子为特异性的上游引物序列，polβ特异引物为下游引物序列，来证实转染细胞中外源基因的存在. 上游引物为5′TAATACGACTCACTATAGGGAGA3′，下游引物为5′ ACTCGTATCATCCTGCCGAA3′，野生型和突变型polβ扩增片断大小分别为312 bp和254 bp,而未转染CHO细胞及转染空质粒细胞无相应片断. PCR反应总体积为30 μL,反应体系中含1.5 mmol/L MgCl2,10×PCR缓冲液3 μL,200 μmol/L dNTP,上下游引物各0.25 μmol/L,Taq酶8.335U,逆转录产物5 μL. PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，54℃退火50 s，72℃延伸50 s，30个循环后，72℃延伸7 min. 取两种转染细胞和转染空载体及未转染CHO细胞的RTPCR产物各5 μL，与上样缓冲液混合后进行15 g/L琼脂糖电泳.

1.2.2检测CHO的生长曲线和细胞周期取野生型polβ转染组对数生长期（CHOPW）细胞一瓶，消化、细胞计数. 取96孔培养板，每孔接种2×103个细胞，补充培养液至200 μL,按常规条件培养. 共设5个复孔，共接种6块板. 接种后，每24 h取出一培养板，加MTT 20 μL/孔，继续培养4 h. 小心吸除孔中的培养液，加入酸化异丙醇200 μL/孔，在水平摇床上振摇10 min,至紫色颗粒完全溶解. 在酶标仪上490 nm处测每孔的A并求出平均值. 连续测6 d. 以时间为横坐标，A值为纵坐标，绘生长曲线. 同法、同时接种缺失型polβ转染组（CHOPM）, 空载体转染组细胞（CHOneor，neor基因是载体pcDNA3.1中的标记基因，具有氨基糖苷抗生素G418抗性）和未转染组 CHO细胞，测A值、绘生长曲线. 另取汇合度达80%~90%的细胞一瓶，常规消化制成单细胞悬液，PBS洗两遍，10 g/L的多聚甲醛1 mL固定5 min. 使用BD公司DNA试剂盒依照说明处理样品. 加A液（胰蛋白酶）250 μL/样品，轻混，室温放置10 min. 加B液（中和液，且含RNase） 200 μL/样品, 轻混，室温放置10 min. 加C液（PI染料）200 μL/样品, 轻混，2~8℃，放置10 min. 上机前用300目尼龙网过滤样品. 上机测试. 每组实验至少进行5次，图像分析采用Cell Quest软件.

统计学处理： 采用SPSS 10.0软件，组间A值比较采用双因素方差分析，各组细胞S期比例的比较采用单因素方差分析. P<0.05为有统计学意义.

2结果

2.1RTPCR产物鉴定将RTPCR产物与DNA标准参照物一同电泳，所得的扩增产物为单一、特异性产物. 扩增片断为分别为312 bp和254 bp,与理论相符（Fig 1）.

2.2DNA polβ转染细胞生长曲线转染空载体和野生型DNA polβ基因对CHO细胞生长影响不大(P>0.05, Fig 2)，而突变型DNA polβ基因转染CHO细胞后，其生长速度明显加快(P<0.05).

2.3polβ基因转染对CHO细胞周期的影响转染突变型polβ（CHOPM）、转染野生型polβ（CHOPW）和未转染组（CHO）细胞S期比例分别为51.9±0.5，45.9±0.6，45.4±0.5. 表明CHOPM组S期比例明显增高，与CHO相比差异有统计学意义（P<0.05）；而CHOPW组S期比例与CHO组细胞相比无统计学差异(P>0.05).

3讨论

人类polβ基因位于8p12p11，全长35 kb,单拷贝基因，有14个外显子及13个内含子组成. polβ不具有核酸内切酶和外切酶活性，更没有3′5′校读活性，这使得它在DNA复制过程中保真度很低［1］. 食管癌、乳腺癌、胃癌等都有DNA polβ基因突变［2,3］. 我们在30例浸润型食管癌标本中观察到13例polβ发生变异(43.3%). 其中7例癌组织中存在相同58 bp(177到234位核苷酸)的基因片段缺失［2］. 进一步研究表明，polβ的突变体，其BER功能明显降低或缺如，甚至干扰了野生型polβ的BER功能. 我们检测了转染组和对照组的细胞周期，发现突变的polβ引起S期比例明显增高. 而野生型polβ对细胞周期并无明显影响.

高表达突变的polβ可能影响到细胞周期G1/S调控点蛋白功能失调，进入S期细胞增多. Kirsten等［4］发现在polβ缺陷的细胞经烷化剂MMS处理后2~5 h，S期比例增加；而在15~30 h后，G2/M期明显增高. 相反，在野生型细胞中，同样剂量的MMS对细胞周期的影响是非常小的. 结果显示MMS引起DNA损伤（包括单链和双链DNA损伤），由于polβ的缺陷无法修复损伤，在早期引起细胞短暂性的停止在S期，在晚期细胞停滞在G2/M期. 总之，polβ基因的突变和表达异常可能影响到染色体的稳定性和细胞增殖基因的失调或改变，在肿瘤的发生发展中起一定的作用.

【参考文献】

［1］ Osheroff WP, Jung HK, Beard WA, et al. The fidelity of DNA polymerase during distributive and processive DNA synthesis［J］. Biol Chem, 1999; 274: 3642-3650.

［2］ 董子明，赵国强，赵勤，等. 人食管癌中polβ基因突变的研究［J］．中华医学杂志，2002；82（13）：899-902.

Dong ZM, Zhao GQ, Zhao Q, et al. A study of DNA polymeraseβ mutation in human esophageal cancer［J］. Nat Med J Chin, 2002;82（13）：899-902.

［3］ Nandan B, Huanchao Ch, Sharon G, et al. Alteration of hMSH2 and DNA polymerase beta gene in breast carcinomas and fibroadenomas［J］. Biochem Biophy Res Commun, 1999;259: 429-435.

［4］ Kirsten O, Jochen L, Simone P, et al. Deficiency in DNA polymerase beta provokes replicationdepentent apoptosis via DNA breakage,bcl2 decline and caspase3/9 activation［J］. Cancer Res, 2002; 62:1524-1530.