TanⅡA 对妊娠期子痫血清刺激 HUVEC 的影响

子痫前期是导致孕产妇和新生儿病死率增高的主要原因之一。该病病因和发病机制迄今尚未明确。滋养细胞过度凋亡、血管内皮细胞功能障碍、炎症及免疫反应可能是导致妊娠期高血压疾病的关键。其中，血管内皮激活、功能障碍和结构损伤是妊娠期高血压疾病发病机制的中心环节之一。蒋荣珍等［1］利用子痫前期患 者 血 清 对 已 培 养 的 正 常 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞（human　umbilical　vein　endothelial　cells，HUVEC）进行损伤的研究，为本实验建立实验模型奠定了基础。丹参酮（tanshinone，Tan）ⅡA是丹参的脂溶性有效单体，具有保护血管内皮细胞的作用［2－3］。本研究观察TanⅡA对子痫前期患者血清刺激HUVEC的影响，旨在为TanⅡA临床治疗子痫前期提供理论依据。现将研究结果，报道如下。

1　资料与方法

1．1　研究对象选择

2010年12月至2011年4月自哈尔滨医科大学附属第一医院住院分娩的20例子痫前期患者采集的60份血清标本（每例患者采集3份）为研究对象。子痫前期诊断标准参照《妇产科学》（7版）［6］。60份血清标本根据是否使用TanⅡA对子痫前期患者血清刺激HUVEC进行预处理，分为子痫前期组（n＝20）、1．0mg／L　TanⅡA处理组（n＝20）和2．0mg／L　TanⅡA处理组（n＝20）；随机选取同期于相同医院就诊的20例正常晚孕期妇女的20份血清标本（每例孕妇采集1份）纳入空白对照组（n＝20）。本组子痫前期患者和正常晚孕期妇女平均年龄分别为（28．6±3．2）岁和（27．5±2．8）岁，标本采集时平均孕龄分别为（33．7±2．6）孕周和（35．1±1．7）孕周，分别比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。（本研究遵循的程序符合本院人体试验委员会所制定的伦理学标准，得到该委员会批准，分组征得受试对象本人的知情同意，并与之签署临床研究知情同意书）。

1．2　实验方法

1．2．1　采集血液标本

20例子痫前期患者与20例正常晚孕期妇女均于空腹状态下，分别采集肘静脉血（治疗前）10mL，3000r／min，离心5min后，取上清液置于1．5 mL环 氧 树 脂 （epoxide，Ep）试 管 中，于－80℃低温保存备用。

1．2．2　细胞来源及实验试剂与仪器

HUVEC系CRL1730和F－12K培养液（ATCC公司，美国），胎牛血清 （GIBCO公 司，美 国），内 皮 细 胞 生 长 添 加 物（endothelial　 cell　 growth　 supplement，ECGS）（Sciencell公司，美国），cell　counting　kit－8（CCK－8）试剂盒（Dojindo公司，日本），Tan ⅡA（中国食品生物制品研究院标准品），CO2孵箱（Forma　Scientific公司，美国），全自动酶标仪（TECAN公司，瑞士）等。

1．2．3　人脐静脉内皮细胞的培养

采用含ECGS及10％胎牛血清的F－12K培养液进行HUVEC培养，并放置于5％CO2孵箱中37℃保存，待细胞生长融合后，使用胰蛋白酶消化，以1∶2比例进行传代，每隔1d更换培养液或进行传代。1．2．4　丹参酮ⅡA溶液配制　将TanⅡ溶于二甲基亚砜（dimethyl　sulfoxide，DMSO）中，使用前加入培养液稀释，将其配制为1．0mg／L和2．0mg／L　TanⅡA溶液，使DMSO终浓度为0．02％（DMSO终浓度≤0．1％时，对细胞生物性状无显著影响）。

1．2．5　CCK－8法测定人脐静脉内皮细胞的活力

HUVEC消化后，制成单细胞悬液，以5000个／孔的细胞密度接种至96孔板（100μL／孔）。孵育24h后，采用PBS缓冲液洗去未贴壁细胞，待HUVEC生长融合至80％后，更换无血清培养基进行饥饿培养24h。子痫前期组HUVEC加入含10％子痫前期患者血清标本的培养基培养24h和48h待测；将1．0mg／L　TanⅡA处理组和2．0mg／L　TanⅡA处理组HUVEC分别加入含1．0mg／L和2．0mg／L　TanⅡA培养液进行预处理，孵育30min后再加入10％子痫前期患者血清标本培养基继续培养24h和48h待测；空白对照组HUVEC仅加入含10％正常晚孕期妇女血清标本培养基培育24h和48h待测。每组每份标本均设5个复孔和1个空白孔（10％血清培养基）。按照上述方法处理各组细胞，每次更换培养液量均为100μL／孔。每孔各加入CCK－8溶液10μL，继续培养1．5h后终止培养。使用全自动酶标仪（波长为450nm）测定各孔光密度（optical　density，OD）值，记录结果。1．3　统计学分析本研究数据采用SPSS　13．0统计学软件包进行统计学处理，呈正态分布计量资料，以珚x±s来表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0．05示差异有统计学意义。

2　结果

2．1　倒置显微镜下观察内皮细胞形态

倒置显微镜下各组内皮细胞形态（图1）。空白对照组镜下可见HUVEC细胞形态呈单层镶嵌状排列，细胞呈扁平圆形或多角形“铺路石”状；子痫前期组镜下可见HUVEC细胞形态呈典型损伤改变，细胞稀疏，细胞质与细胞核界限模糊，细胞质中有暗色颗粒；1．0mg／L　TanⅡA处理组和2．0mg／L　TanⅡA处理组镜下可见HUVEC细胞形态呈多角形、椭圆形排列紧密，细胞边界清楚。

2．2　CCK－8检测内皮细胞活力

4组HUVEC经不同方法处理后继续培养24h和48h所测OD值结果（表1）显示：子痫前期组与空白对 照 组 比 较，差 异 有 统 计 学 意 义 （P ＜0．05）；1．0mg／L　TanⅡA处理组、2．0mg／L　TanⅡA处理组分别与子痫前期组比较，差异均有统计学意义（P＜0．05）；而1．0mg／L　TanⅡA处理组与2．0mg／L　TanⅡA处理组比较，差异亦有统计学意义（P＜0．05）。

3　讨论

血管内皮功能失衡为引起子痫前期的关键性生理异常因素［4］。血管内皮细胞具有选择性屏障、传递信息及分泌一氧化氮（nitric　oxide，NO）等功能，并具有调节血管张力、凝血和纤溶系统平衡及血管壁炎症反应等作用。氧化反应在血管内皮细胞损伤和功能变化中具 有 关 键 作 用［5］。炎 性 介 质，如 肿 瘤 坏 死 因 子（tumor　necrosis　factor，TNF）， 白 细 胞 介 素（interleukin，IL）－6，极低密度脂蛋白（very　low　densitylipoprotein，VLDL）等均可促进氧化应激反应，导致类脂过氧化物持续产生，并产生大量毒性因子，引起血管内皮损伤［6］。由于各种致病因素的存在，可致胎盘缺血缺氧，从而引发一系列血管活性物质及毒性因子释放，引起全身小血管痉挛及损伤而导致子痫前期。当血管 内 皮 细 胞 受 损 时，血 管 舒 张 因 子 前 列 环 素（prostaoyctin，PGI2）分泌减少，由血小板分泌的血栓素（thromboxane，TX）A2增加，导致PGI2／TXA2下降，增加血管紧张素（angiotensin，Ang）Ⅱ的敏感性，使血压升高，导致一系列病理变化的发生［6］。TanⅡA对血管内皮的保护作用机制为：可有效降低细胞脂质过氧化作用，从而减少脂质过氧化造成的内皮细胞结构损伤或功能障碍。Lin等［2］研究表明，TanⅡA对HUVEC氧化损伤具有保护作用。范英昌等［7］发现，TanⅡA可通过降低缩血管因子内皮素（endothelin，ET）－1和TXA2含量，增加舒血管因子NO含量，而发挥治疗子痫前期作用。血管内皮细胞的多种生理功能均与细胞内游离Ca2＋浓度密切相关［8］。李永胜 等［9］研 究 发 现，TanⅡA可 部 分 抑 制AngⅡ诱导的内皮细胞Ca2＋升高。

本研究结果显示，子痫前期组HUVEC形态严重受损，TanⅡ干预可使呈典型损伤改变的HUVEC获得部分修复。子痫前期组与空白对照组HUVEC活力比较，差异有统计学意义（P＜0．05），提示子痫前期组HUVEC损伤导致HUVEC活力下降；1．0mg／LTanⅡA处理组、2．0mg／L　TanⅡA处理组分别与子痫前 期 组 比 较，及1．0 mg／L　TanⅡ A处 理 组 与2．0mg／L　TanⅡA处理组比较，差异均有统计学意义（P＜0．05）则提示，TanⅡA可抑制细胞活性降低，并且随着TanⅡA浓度增大，HUVEC活力逐渐增大。