川芎嗪对泡沫细胞胆固醇逆转运的有效性分析

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的主要原因和病理基础,表现为大动脉及中动脉的血管内壁出现脂质沉积,形成分散或成片的粥样斑块,造成动脉管腔狭窄, 随后斑块破裂出血,可在狭窄的动脉内形成血栓,导致缺血性脑卒中、心肌梗死发生。巨噬细胞泡沫化是早期动脉粥样硬化病变的标志之一,其形成主要原因是细胞内胆固醇平衡被打破,巨噬细胞大量摄取ox-LDL颗粒,在胞内大量蓄积胆固醇酯[1],而PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路介导的胆固醇逆转运在维持巨噬细胞内胆固醇含量的动态平衡至关重要[2]。川芎嗪(ligustrazine)又名四甲基吡嗪(TMP),是中药川芎的主要药效成分之一。现代研究表明川芎嗪能通过抑制氧自由基的生成及增强氧自由基的清除,降低脂质过氧化反应,减缓动脉粥样硬化斑块形成,但其具体的机制尚未明确[3]。本研究拟从调节PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路角度探讨川芎嗪对泡沫细胞的影响,为川芎嗪抗AS作用机制的研究和临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1细胞株与试剂 RAW264.7细胞株购于中国科学院上海细胞库;川芎嗪(纯度99%)购自安徽甙尔塔研究所;1640培养基、胰酶、新生小牛血清等购自杭州皓天生物技术有限公司;佛波酯(PMA)和油红O染料购自Sigma公司;荧光定量试剂盒购于TAKALA公司;PCR引物由上海生物工程公司合成; β-actin,PPARγ,LXRα,ABCA1抗体均购于Santa Cruz 公司。

1.2ox-LDL 制备 取300 mL健康人血浆,采用密度梯度离心法(1.019~1.063 g·mL-1)分离获得LDL,经凝胶过滤获得纯化LDL,LDL浓度定量后用PBS(pH 7.4)稀释至80 mg·L-1,加入1 mmol·L-1 CuSO4溶液使Cu2+ 终浓度为10 μmol·L-1,于37 ℃水浴氧化24 h。氧化后用含EDTA·2Na的PBS缓冲液透析24 h,终止氧化。ox-LDL经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后琼脂糖凝胶电泳法鉴定LDL的氧化程度,最后Lowry法测定蛋白浓度,于4 ℃ 避光保存备用。

1.3川芎嗪对泡沫细胞增殖活力的影响 将RAW264.7细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,于37 ℃,5%CO2培养箱静置培养。加入含20 mg·L-1的ox-LDL及含3%胎牛血清的RPMI1640培养液共同孵育24 h。RAW264.7细胞诱导分化成泡沫细胞后,培养液中加入不同浓度川芎嗪(0,20,40,60,80,100,120,140 mg·L-1)干预24 h后,加入20 μL MTT 孵育4 h后,加入DMSO 150 μL震荡10 min,在波长570 nm处检测吸光度A570。

1.4细胞内胆固醇酯含量测定 1 200 r·min-1离心5 min,弃上清收集细胞,加入80 μL无水乙醇,超声10 s,工作10次,功率160 W,总胆固醇超声提取完毕后,1万r·min-1离心5 min,将上清液转移至新的EP管中,细胞内脂质含量按照脂质测定试剂盒说明书分别测定总胆固醇(TC)及游离胆固醇(FC)的含量,胆固醇酯(CE)含量即为TC和FC之差值。

1.5细胞内脂质测定 细胞接种于6孔培养板内,随机分为对照组(正常培养的RAW264.7细胞)、泡沫细胞组(20 mg·L-1的ox-LDL处理RAW264.7细胞24 h)、川芎嗪组(60 mg·L-1川芎嗪处理泡沫细胞24 h)。处理后,弃去6孔板中的上清液,用PBS轻轻洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,再用PBS轻轻洗1次,然后 60%的异丙醇固定5 min,轻轻吸去异丙醇后加入0.5%油红O,在37 ℃染色20 min,去上清再用PBS清洗3次,置显微镜下观察并摄像。

1.6荧光定量PCR检测PPARγ, LXRα, ABCA1 mRNA的表达 按TRIZOL试剂盒说明书一步法提取各处理组细胞总RNA,用紫外分光光度法测RNA在260 nm和280 nm的吸光度A,其A260/A280为1.92。并根据260 nm的A对样品的总RNA进行初步定量,并用Invitrogen逆转录试剂盒合成 cDNA,再通过引物进行荧光定量PCR扩增。包括β-actin引物:上游5′-CTGACCCTGAAGTACCCCATT-3′,下游5′-TCTGCGCAAGTTAGGTTTTGT-3′,扩增产物长度324 bp; PPARγ引物:上游5′-ATAAAGCATCAGGCTTCCACT-3′,下游5′-GCACTTCTGAAACCGACAGTA-3′,扩增产物长度143 bp。LXRα引物:上游5′-TCTGGAGACATCTCGGAGGTA-3′,下游5′-GGCTCACCAGTTTCATTAGCA-3′,扩增产物长302 bp;ABCA1引物:上游5′-CTCAGAGGTGGCTCTGATGAC-3′,下游5′-CCCATACAGCAAGAGCGAAG-3′,扩增产物长度284 bp;采用Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix荧光预混液于Bio-Rad iQTM5多重实时荧光定量PCR仪系统来检测上述引物产品的mRNA表达量,实验结果以β-actin的mRNA进行标准化

1.7Western blot检测PPARγ, LXRα, ABCA1蛋白质的表达 收集各组细胞,用预冷的PBS缓冲液清洗3~5次,按照细胞膜蛋白抽提试剂盒提取膜蛋白,并用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。20 μg膜蛋白样品与上样缓冲液按比例混合后煮沸5 min,SDS-PAGE电泳80 V恒压2 h,WB湿转(0.45 μm的PVDF膜)200 mA恒流2 h,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,TBST漂洗3次后分别加入一抗(1∶200稀释)和β-actin(1∶300稀释)4 ℃孵育过夜,TBST漂洗3次,于37 ℃二抗(1∶1 000稀释)反应2 h后进行ECL显色。以β-actin作为内参,计算各处理组目的蛋白的表达。

1.8统计学处理 实验数据以±s表示,采用SPSS 10.0统计软件分析数据,并采用双尾t检验进行统计学意义评估。

2结果

2.1川芎嗪对RAW264.7细胞源泡沫细胞增殖的影响 不同浓度的川芎嗪与RAW264.7细胞源泡沫细胞共培养24 h后,用MTT法测定细胞的活性,结果表明,川芎嗪小于60 mg·L-1时对泡沫细胞增殖活性无明显影响,当川芎嗪大于80 mg·L-1时泡沫细胞增殖活性明显受抑制(图1)。

2.2川芎嗪对泡沫细胞内胆固醇含量的影响 20 mg·L-1ox-LDL诱导RAW264.7细胞后,细胞内的胆固醇酯与总胆固醇明显增加,胆固醇酯与总胆固醇比值达到47.62%。经川芎嗪干预后,细胞内总胆固醇(TC)和胆固醇酯与总胆固醇的比值(CE)均下降(表1),且具有一定的量效关系。结合细胞增殖检测的结果,本实验选择60 mg·L-1作为川芎嗪处理浓度。

2.3川芎嗪调节泡沫细胞内脂质的积累 正常RAW264.7细胞中油红O染色阳性细胞很少。ox-LDL处理后RAW264.7细胞由于大量摄取ox-LDL导致胞内脂质堆积,油红O染色阳性,脂滴较大,且细胞体积增大,形态多呈圆形或不规形,符合泡沫细胞的特征。60 mg·L-1川芎嗪处理后RAW264.7细胞中油红O染色阳性细胞明显下降(图2),可以看出60 mg·L-1川芎嗪能显着抑制泡沫细胞脂质的累积。

2.4川芎嗪对泡沫细胞PPARγ, LXRα和ABCA1 mRN A表达的影响 60 mg·L-1川芎嗪处理泡沫细胞后,细胞中PPARγ,LXRα和ABCA1 mRNA表达水平明显高于模型组。说明川芎嗪能增加PPARγ,LXRα和ABCA1 mRNA表达(图3)。

2.5川芎嗪对泡沫细胞PPARγ,LXRα和ABCA1蛋白表达的影响 应用免疫印迹法对各组细胞PPARγ,LXRα和ABCA1蛋白表达进行检测,实验结果显示β-actin 蛋白条带均一,可用于实验数据分析。与泡沫细胞组相比,60 mg·L-1川芎嗪组细胞中PPARγ,LXRα和ABCA1蛋白表达水平明显增加。进一步说明川芎嗪能增加PPARγ,LXRα和ABCA1的表达而抑制泡沫细胞的形成(图4)。

3讨论

泡沫细胞主要来源于单核巨噬细胞,巨噬细胞通过细胞表面的LDL受体摄取 LDL且受细胞内胆固醇浓度的负反馈调节。但LDL被氧化修饰形成ox-LDL后,其受体识别位点发生了改变,即不能由LDL受体识别,而被巨噬细胞上的清道夫受体等识别和摄取,且不受细胞内胆固醇含量的负反馈调节,从而使胆固醇在细胞内过量积聚而形成泡沫细胞,最终导致AS的发生。

泡沫细胞的形成与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)有关。PPAR即过氧化物酶体增殖激活受体,同属于核受体超家族成员,有α,δ和γ3类亚型,与巨噬细胞内胆固醇平衡密切相关。PPARα的激活,可提高HDL水平、激活LXR、进一步促进ABCA1表达等,抑制泡沫细胞生成[4]。PPARγ在泡沫细胞生成过程中可能扮演“双刃剑”的角色[5],ox-LDL可上调巨噬细胞PPARγ的表达,导致巨噬细胞对ox-LDL的摄取增加,形成正反馈,促进泡沫细胞形成[6]。但PPARγ激动剂可通过促进胆固醇逆转运蛋白(ABCA1)的转录,加速胆固醇逆转运出巨噬细胞而发挥抗动脉粥样硬化作用[7]。

ABCA1是三磷酸腺苷结合转运体超家族(ABC超家族)成员。它是一类膜蛋白,可介导胆固醇从细胞内流出至载脂蛋白AI(apoAI)上,相互作用形成紧密交叉连接,即ABCA1可以与apoAI形成复合物,并结合细胞内胆固醇后形成新生HDL颗粒,促进胆固醇流出[8-9]。肝LXR属核激素受体蛋白质超家族成员,其特异性配体为氧化固醇。巨噬细胞中激活LXRα后ABCA1,ABCG1及ApoE表达增加,促进胆固醇逆运转。且LXR与PPAR通路耦联,增加ABCA1的表达,调控脂质摄入和逆转运[10]。

川芎嗪来源于伞形科植物川芎的干燥根茎,为吡嗪类生物碱。川芎辛香行散,温通血脉,上行头颠,下走血海,功能活血行气,祛风止痛,被前人誉为血中之气药[11]。对于治疗缺血性脑血管及冠心病效果良好,还可以治疗偏头痛和重症肺心病。He等[12]实验还证明川芎嗪能通过诱导PPARγ的表达缓解PPARγ拮抗剂-恶唑酮诱导的结肠炎。因此推测,川芎嗪是PPARγ的激动剂之一,可以通过诱节LXRα,ABCA1表达而促进细胞内胆固醇外流。

实验中发现川芎嗪能抑制泡沫细胞中脂质的累积, 60 mg·L-1 川芎嗪能降低泡沫细胞内总胆固醇及胆固醇酯与总胆固醇的比值,并促进 PPARγ,LXRα和ABCA1 mRNA 和蛋白的表达,因此,推测川芎嗪可以通过调节 PPARγ-LXRα-ABCA1 途径,增加胆固醇逆转运,进而起到抗动脉粥样硬化作用