TLR4受体在肝癌细胞株HepG-2的表达

[摘要] 目的：探讨TLR4受体在肝癌细胞株HepG-2和肝癌组织中的表达。方法：用RT-PCR和Western-blot方法检测肝癌细胞株HepG-2中TLR4基因的转录和蛋白的表达的情况，同时用免疫组化的方法检测肝癌组织中TLR4的表达的情况。结果：肝癌细胞株HepG-2中存在TLR4基因的转录和蛋白的表达。TLR4受体主要表达位于肝癌组织细胞的细胞膜上，其阳性率约为76.7%。结论：肝癌细胞株HepG-2和肝癌组织中均有TLR4的表达。

[关键词] HepG-2；肝癌；TLR4；RT-PCR；Western-blot

[中图分类号] R73-3[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）06（c）-019-02

The expression of TLR4 on human hepatocellular carcinoma cells HepG-2

SUI Chun-yang1, LI Jia1, HU Yong2, GUO Ren-xuan3

(1.Department of General Surgery, Fengtian Hospital, Shenyang Medical University, Shenyang 110001, China;2.the Second People's Hospital of Panjin City,Panjin124010,China;3.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China)

[Abstract] Objective:To investigate the expression of TLR4 on human hepatocellular carcinoma cells HepG-2 and tissue. Methods:To detect the expression of TLR4 mRNA and protein on human hepatocellular carcinoma cells HepG-2 by RT-PCR and Western-blot. To detect the expression of TLR4 protein on human hepatocellular carcinoma tissue by S-P immunohistochemical method. Results: The TLR4 could be detected on human hepatocellular carcinoma cells HepG-2.Cells staining for TLR4 show yellow or brow granules located on cell membrane in human hepatocellular carcinoma tissue. The positive rate was 76.7%.Conclusion:Human hepatocellular carcinoma cells HepG-2 and cells of human hepatocellular carcinoma tissues have the expression of TLR4.

[Key words] TLR4；Hepatocellular carcinoma；HepG-2；RT-PCR；Western blot

研究表明，TLR4不仅表达在免疫系统相关的细胞中，许多肿瘤细胞表面都表达TLR4，这可能与肿瘤的免疫微环境的建立与维持有关[1]。例如胃癌的细胞表面有TLR4的表达，其使胃癌细胞与幽门螺杆菌相互作用而诱导产生促胃癌细胞生长的因子[2]。TLR4在一些肝脏疾病如病毒性肝炎、肝硬化、肝纤维化、酒精性肝病等的发生及发展机制中亦有重要作用 [3]。那么，TLR4在肝癌细胞中是否有表达，是否影响肝癌的发生发展呢？本实验将检测肝癌组织和细胞株HepG-2是否有TLR4的表达。

1材料与方法

1.1 细胞培养

HepG-2（购自肿瘤研究所）在含10%胎牛血清的（FBS）的RPMI-1640培养基中常规培养，95%湿度，5% CO2，37℃。每2~3天换培养基1次，每周传代1次。选生长状态好，处于对数生长期的细胞进行试验。

1.2 RT-PCR

取1×107细胞，加入Trizol 1 ml,按总RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取细胞总RNA。引物均经GenBank查询为目前已知基因特异性引物序列：TLR4上游5’-CTGCAATGGATCAAGGACCA-3’，下游5’-TCCCACTCCAGGTAAGTGTT-3’； β-actin上游5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’下游5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’（大连宝生物合成）。按第一链合成试剂盒说明进行逆转录 (Takara)。PCR扩增条件：变性94℃1 min，退火56℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，循环30次。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化乙锭染色后观测照相。

1.3 Western blot

在收集好的各组细胞中加入500 μl裂解液，匀浆，10 %SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素薄膜上，5%脱脂奶粉包被2 h，加入1∶300 TLR4一抗（武汉博士德）4℃孵育过夜。1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育2 h，TBS洗净后，加显色剂，10~30 min后看结果。

1.4 免疫组化

用于免疫组化的标本来源于中国医科大学附属第一医院1999年1月~2005年12月手术切除肝细胞癌标本30例，所有标本均经病理证实，男性19例，女性11例，平均55岁，高分化腺癌20例，中分化腺癌8例，低分化腺癌2例。标本石蜡包埋后切片。切片经脱蜡，酒精水化，过氧化氢封闭，3％正常山羊血清孵育后，滴加一抗（1100）4℃冰箱孵育过夜，滴加生物素标记的二抗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液，DAB显色。

2 结果

2.1 RT-PCR 结果

如图1所示，在肝癌细胞株HepG-2中存在TLR4基因的转录。

2.2 Western-blot 结果

如图1所示：在肝癌细胞株HepG-2中存在TLR4蛋白的表达。

2.3 免疫组化

肝癌组织中有TLR4的表达，其阳性率约为76.7%（23/30）。主要表达位于细胞的细胞膜上，细胞浆中可以有少量的表达（图2）。

（TLR4主要表达位于细胞的细胞膜上，细胞浆中可以有少量的表达）

3讨论

本实验利用免疫组化的方式首先证实了肝癌组织中有大量的TLR4受体的表达，其主要表达位于细胞的细胞膜表面，阳性率达到75%以上。Toll样受体4(TLR4)是新近发现的天然免疫受体，最基本的功能是信号的跨膜转导。最初人们认为，TLR4主要表达于免疫细胞尤其是巨噬细胞和树突状细胞表面，它们可以通过广泛地特异性地识别病原体相关的分子模式(PAMPs)，偶联信号传导途径，并激活天然免疫细胞，最终导致一系列的免疫炎症反应[4]。先前的研究多数集中于免疫细胞上的TLR4，而针对肿瘤细胞表面TLR4的研究很少。目前研究证明，TLR4不仅表达在免疫系统相关的细胞中，在多种肿瘤细胞表面也有表达[5]，而且肿瘤细胞TLR4信号传导途径和免疫细胞基本一致，相反的是肿瘤细胞通过其表面表达的TLR4构建了利于肿瘤细胞生存的微环境，逃避机体的免疫攻击[5]。目前在对肝脏疾病的研究过程中发现TLR4与一些肝脏疾病如病毒性肝炎、肝硬化、肝纤维化、酒精性肝病等的发生及发展机制中亦有重要作用，病毒性肝炎患者DC功能的下降可能与DC中TLR表达有很大相关性[6]。在对HCV 感染后肝硬化[7]及HCV 疫苗[8]研究中也发现TLR4在病毒性肝炎肝细胞损伤中起着重要作用。同样Mozer-Lisewska在HCV感染的肝细胞检测到了TLR4的表达[3]，其可能在慢性病毒性肝炎的病理生理过程中有作用。而病毒感染是肝癌发病的主要原因之一。因此，TLR4就有可能在肝癌的发生和发展中发挥一定的作用。

本实验从基因的角度证明了肝癌细胞株HepG-2中有TLR4基因的转录，从蛋白的角度证实了肝癌细胞株HepG-2中有TLR4蛋白的表达，表明肝癌细胞株HepG-2有TLR4的表达。HepG-2细胞株是目前国际公认的肝癌细胞株，对于肝癌发生、发展、侵袭、转移甚至肝癌的治疗的许多研究都是利用HepG-2细胞株来完成的，本实验证明了肝癌细胞株表面有TLR4的表达，为今后对TLR4在肝癌中的作用及其作用途径的研究提供了实验对象，同时也未今后利用TLR4进行肿瘤治疗提供了实验对象。

[参考文献]

[1]Song PI, Abraham TA, Park Y,et al. The expression of functional LPS receptor proteins CD14 and Toll-like receptor 4 in human corneal cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2001， 42: 2867-2877.

[2]Schmausser B, Andrulis M, Endrich S, et al. Toll-like receptors TLR4, TLR5 and TLR9 on gastric carcinoma cells: an implication for interaction with Helicobacter pylori[J]. Int J Med Microbiol, 2005, 295(3): 179-185.

[3]Mozer-Lisewska I, Sluzewski W, Kaczmarek M, et al. Tissue localization of toll-like receptors in biopsy specimens of liver from children infected with hepatitis C virus[J]. Scandinavian Journal of Immunology, 2005, 62(4): 407-412.

[4]Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors[J].Annu Rev Immunol, 2003, 21: 335-376.

[5]Huang B, Zhao J, Li H,et al. Toll-like receptors on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance[J]. Cancer Res, 2005, 65(12): 5009-5014.

[6]金生,张大志,陈压西.Toll 样受体与肝脏疾病[J].中华内科杂志, 2005, 44(1): 68-69.

[7]Kaisho T, Akira S. Regulation of dendritic cell function through Toll-like receptors[J]. Curr Mol Med, 2003, 3: 373-385.

[8]Duesberg U, Vorr-dem-Bussche A, Kirsching C, et al. Cell activation by synthetic lipopeptides of the hepatitis C virus(HCV)-core protein is mediated by toll like receptors (TLRs) 2 and 4[J]. Immunol Lett, 2002, 84: 89-95.

（收稿日期：2008-02-27）

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