进一步重视创(烧)伤脓毒症的免疫监控

创（烧）伤脓毒症（sepsis）是指来源于创（烧）伤创面或其他途径，并证实有细菌存在或有高度可疑感染灶引起的全身性炎症反应综合征（SIRS），进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（MODS），是创（烧）伤患者死亡的独立危险因素[1]。因此，加强对创（烧）伤脓毒症病理过程的监控和预警非常重要，有助于严重脓毒症及MODS的及时干预与治疗。

1 创（烧）伤脓毒症免疫学进展

近年来创（烧）伤免疫学研究借助生物信息学技术得以迅猛发展，不仅揭示了创（烧）伤时免疫细胞基因表达的动态规律和重要信号转导通路的变化，而且提出宿主免疫防御反应可能的新模式。同时，不断发现的新型免疫细胞及其调节途径，为创（烧）伤脓毒症的免疫监控提供新的策略。

1.1 严重创（烧）伤后机体反应模式的再认识

已被广泛接受的宿主对严重创（烧）伤免疫反应模式是，机体早期出现SIRS，然后继发代偿性抗炎反应综合征（compensatory antiinflammatory responses syndrome，CARS）。但传统的SIRS/CARS模式最近受到了挑战，美国大规模针对“损伤炎症和宿主反应合作研究项目”通过高通量生物信息学技术，对严重损伤患者和注射低剂量内毒素的志愿者进行外周血白细胞基因转录组学研究。结果发现，机体在对创伤的基因组反应中不仅激活大量参与炎性反应、模式识别和抗感染的基因表达，同时也抑制参与抗原识别、T细胞增殖和凋亡、T细胞受体功能和NK细胞功能的基因表达。因此提出新的创（烧）伤打击后机体免疫反应模式，即严重损伤后经典的炎症和抗炎反应，与获得性免疫反应基因表达的改变是同时而不是依次发生的[2]。

1.2 创（烧）伤后免疫功能的改变

除了对创（烧）伤后机体免疫反应模式的新认识，对脓毒症免疫状态及调节机制的研究也日益加深。创（烧）伤脓毒症病理过程中，机体固有免疫反应[包括中性粒细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞（dendritic cell， DC）等]障碍已倍受关注，被认为是诱发脓毒症的重要因素。创（烧）伤后增强的固有免疫反应，尽管介导了有害的全身炎症反应，但也可能通过增强抵御微生物感染的固有免疫对宿主产生有利作用。此外在获得性免疫反应中，T淋巴细胞凋亡增加及调节性T细胞（regulatory T cell， Treg）凋亡减少，可能是脓毒症免疫功能紊乱的关键环节。

1.2.1 单核/巨噬细胞 有报道提示，脓毒症改变髓样细胞和中性粒细胞功能，导致对脓毒症二次感染抵抗力的减弱。此外，脓毒症状态下单核细胞人白细胞抗原（monocyte human leukocyte antigen， mHLA）-DR表达和抗原提呈能力下降，减少细胞因子和其他促炎因子的表达，但促进IL-10的产生，因此破坏了固有免疫和获得性免疫之间的联系[3]，与患者不良预后密切相关[4]。新近资料证实，单核细胞在特定条件下可分化为经典激活的M1表型分泌促炎细胞因子，替代激活的M2表型分泌抗炎细胞因子。脓毒症患者单核细胞CD163和CD206表达增加，提示单核细胞在脓毒症中获得替代激活的M2表型[5]。

1.2.2 树突状细胞 DC是体内重要专职抗原呈递细胞，临床资料显示DC凋亡及数量减少对脓毒症发生发展具有促进作用。患者外周血DC数量在并发脓毒性休克后明显降低，与病情严重程度及不良预后密切相关。动物实验证实，脓毒症时脾脏及淋巴结中DC数量均明显减少。利用转基因技术特异性去除小鼠体内DC后，脓毒症动物病死率显著增加；同样，特异性去除动物体内DC，脓毒症小鼠存活率明显降低，而补充野生型骨髓源性DC则可显著改善其预后。DC凋亡不仅导致其自身成熟障碍和抗原呈递能力下降，还可诱导初始T细胞向负向调节细胞Treg分化[6]。这些资料说明，DC抗原呈递能力下降及其数量减少是免疫功能障碍的重要机制之一。

1.2.3 T细胞 辅T细胞（T helper， Th）一直认为是获得性免疫的重要组成部分。现今主要的Th细胞亚群包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和Tregs，每一类亚群都在独特的转录调节下产生特殊的效应因子。众多资料显示，严重损伤状态下T淋巴细胞功能失调，包括淋巴细胞增殖活性受抑、IL-2分泌减少、Thl/Th2比值和CD4+/CD8+T细胞比例的异常改变等，是导致免疫功能障碍的重要因素。在临床上，50%脓毒症死亡患者外周血淋巴细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降，凋亡的淋巴细胞显著增加。小鼠在严重烧伤3 h后，脾脏、胸腺和小肠组织淋巴细胞凋亡明显增多；在家兔腹腔感染诱发脓毒症模型中，术后4 h外周血淋巴细胞明显凋亡，且凋亡率与动物预后密切相关[7]。多种反映T细胞功能的参数与烧伤病情的严重程度以及脓毒症的易感性相关，提示T细胞功能降低可能是烧（创）伤诱发免疫抑制的主要原因。

业已明确，Treg系具有调节功能的成熟T细胞亚群，在脓毒症复杂的免疫调控网络中发挥负向调节作用，既能抑制不恰当的免疫反应，又能限定免疫应答的范围、程度及作用时间，对效应细胞的增殖、免疫活性的发挥起抑制作用[8]，因此在严重创（烧）伤所致脓毒症的病理过程及其干预途径中具有重要意义。新近研究表明，烧伤后机体免疫功能明显受抑，导致对机体感染的抵抗力降低，其中Treg活性增强，12 h即出现细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte- associated antigen-4， CTLA-4）表达增加。严重创伤后患者外周血Tregs活性也增强，并可减少Th1细胞因子的产生[9]。本实验进一步证实，脓毒症大鼠Treg凋亡率显著低于对照组和假手术组，而其抑制功能明显增强。这些结果充分说明Treg在创（烧）伤引起的脓毒症及脓毒性休克中所起的重要调节作用。

Th17淋巴细胞及其效应细胞因子IL-21和IL-22在维持皮肤、肺和小肠的黏膜免疫性和屏障完整性中具有重要作用。最近研究提示，严重创（烧）伤应激和相关感染并发症产生的全身性效应，能影响机体对Th17免疫活性的精细调控。尽管刚入院时脓毒症患者外周血Th17细胞比例高于正常人，但入院后7 d则较刚入院时显著下降[5]。烧伤患者外周血即使加入白色念珠菌抗原，也不会产生Th17细胞[10]。如在烧伤后抑制抗原特异性Th17反应，可能导致感染、远隔器官衰竭和死亡。因此，Th17细胞可能是烧伤后机体产生免疫紊乱的重要因素。

1.3 创（烧）伤后免疫细胞基因表达的动态变化及其与预后的相关性

在上述对损伤的炎症和宿主反应研究中，发现严重应激可诱发“基因风暴”，影响到>80%的细胞功能和信号转导通路，导致整个免疫细胞重新发生极化[2]。首先在内毒素攻击实验中，人外周血白细胞的功能模块包括线粒体生物能产生、蛋白合成和降解的基因在转录水平广泛失调[11]。随后对创伤患者的观察发现，有5136个基因出现至少2倍的变化。基因表达发生改变最显著是在损伤早期（

2 创（烧）伤脓毒症的免疫学监测

创（烧）伤脓毒症研究的飞速发展，给脓毒症的免疫学监测带来更多的可能性。从已有的炎症介质到最新的免疫细胞，从既往的蛋白检测到如今的基因组分析，都使脓毒症的免疫学监测越来越接近个体化、普及化，以期最终达到根据对这些指标的综合分析，得到相对精确、快速、敏感和动态的监测系统。

2.1 炎症介质

许多生物标志物用于评估脓毒症，包括细胞因子/趋化因子、免疫细胞表面标志物、受体标志物、凝血标志物、血管内皮损伤生物标志物、血管扩张、器官功能障碍或急性反应蛋白标志物等[12]。虽然临床可以对多数生物标志物进行检测，如C反应蛋白和前降钙素已经广泛应用于临床，一些新的指标，如高迁移率族蛋白B1在16 ng/mL可提示脓毒症致死性水平，IL-10在14 pg/mL截断水平可预测ICU患者的死亡，但是这些指标在脓毒症鉴别诊断或结果预测上仍有相当的局限性。

2.2 免疫细胞

2.2.1 T细胞 CD4+T淋巴细胞功能障碍与大面积烧伤患者并发脓毒症密切相关。笔者动态监测了严重烧伤患者外周血T淋巴细胞百分率和凋亡率、增殖活性、IL-2分泌水平，观察到脓毒症患者CD3+/CD4+T淋巴细胞百分率于伤后1、5、14、21、28 d均显著低于非脓毒症组，而其凋亡率则明显高于非脓毒症组；非脓毒症组CD3+/CD4+T淋巴细胞百分率仅在伤后3 d呈现一过性降低。脓毒症组T淋巴细胞增殖能力及IL-2分泌水平在伤后l、14、21、28 d显著低于非脓毒症组。相关性分析显示，严重烧伤后外周血T淋巴细胞增殖能力与IL-2分泌水平呈显著正相关[13]。因此，动态监测T淋巴细胞增殖反应、IL-2水平、CD3+/CD4+T淋巴细胞数量与凋亡情况等，对了解T淋巴细胞免疫功能状态及分析烧伤病情的变化可能有重要临床指导意义。

严重创（烧）伤可促进外周血Treg细胞的免疫抑制功能成熟，并刺激其分泌大量抑制性细胞因子，从而造成机体免疫功能障碍甚至紊乱的发生，其中以特重烧伤、并发脓毒症及预后不良者表现尤为突出。有学者证实脓毒性休克患者Tre生明显增多，同时其表面分子CTLA-4也呈过表达状态，而且在HLA-DR低表达的脓毒症死亡患者中，入院10 d后Treg仍持续增加，与其预后不良相关。临床资料证实，Treg表面分子及其分泌的抑制性细胞因子与严重烧伤患者并发脓毒症密切相关，并可能在烧伤脓毒症患者不良预后中扮演着重要角色[14]。今后在临床实践中，如果能对烧伤患者外周血Treg数量、比例及其介导T细胞免疫反应进行常规分析，则有望成为一种反映烧伤脓毒症患者免疫功能障碍程度简单而有效的检测方法。

2.2.2 树突状细胞 有研究分析了髓样DC（myeloid DC，mDC）和浆样DC（plasmacytoid DC，pDC）的变化规律，发现烧伤后第1天脓毒性休克患者早期外周血mDC和pDC数量均明显下降，至少持续到伤后7 d。而且mDC数量的持续降低和患者获得性感染的发生相关，提示mDC和pDC亚群的减少是脓毒症免疫抑制功能性特征，mDC/pDC比值可能是烧伤脓毒症的预警指标[15]。

2.2.3 单核细胞 创（烧）伤早期单核细胞HLA-DR表达下降，在脓毒症状态下尤为严重。目前，CDl4+单核细胞mHLA-DR表达已作为临床诊断免疫抑制状态并监测ICU患者免疫功能的重要指标。我们应用精确的实验方法——细胞荧光分子定量技术证实，脓毒症组mHLA-DR结合抗体量在烧伤后逐步下降，而非脓毒症组伤后5 d以后持续升高；烧伤脓毒症患者死亡组mHLA-DR结合量在伤后3 d即显著低于生存组，且一直持续至21 d。表明严重烧伤脓毒症患者存在持续性免疫功能低下，mHLA-DR表达障碍与患者不良预后密切相关[4，16]。最近通过绘制反映敏感性和特异性连续变量的受试者工作特征曲线发现，mHLA-DR在入院后第3 天和第7 天相对于0 d的变化值ΔmHLA-DR3和ΔmHLA-DR7，可能是严重脓毒症患者比较可靠的预警指标[17]。

2.3 白细胞基因表达

通过统计学方法分析早期基因改变与临床预后的关系，发现1/4早期改变的基因与创伤后长期炎症反应并发症相关，尤其是下调的主要组织相容性复合体Ⅱ类分子基因（编码参与抗原呈递的蛋白）和上调的p38 丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路（促进炎症反应）与创伤后长期并发症具有非常显著的相关性，可作为判断患者预后的有力指标[18]。采用同样方法发现，138个标签基因能够对脓毒症和SIRS进行鉴别诊断。同SIRS相比，脓毒症参与炎症反应和免疫调节的基因表达明显下调，而参与凋亡的基因则在脓毒症患者呈高表达。

3 展望

今后的研究需要通过高通量基因组（基因表达芯片）以及蛋白组学（质谱或抗体芯片）技术，鉴别在疾病过程中发生免疫紊乱的新功能模块，描绘出使患者出现不同预后的基因组或蛋白质组通路，有利于对脓毒症预后进行及早预测[11]；同时，需要鉴定大量可能的生物标志物，并从众多候选标志物中选择有临床价值的标志物组合，通过生物学网络分析将其结合起来建立统计学模型[19]，综合评估这些预警分子在疾病分类（检测、诊断和预测）中的意义。

迄今为止，国内外尚未建立创（烧）伤脓毒症免疫障碍分层诊断系统。鉴于脓毒症病理过程的复杂性，不太可能找出单一的理想生物标志物，将一些脓毒症标志物进行组合，将有助于提高分类的准确性和临床应用价值[4，20]。既往反映机体炎症和免疫应答状态的标记分子，它们在判断脓毒症严重程度中的确切权重和效率，尚缺乏结合病情评分的相关研究。笔者认为，很有必要通过对创（烧）伤脓毒症患者病情严重程度的评分和对免疫细胞及其调节分子表达动态变化的监测，以严重脓毒症发生率及患者预后为因变量，以上述指标作为自变量进行统计分析，对不同指标的权重进行评估，从而建立评价创（烧）伤脓毒症免疫功能的数学模型。并通过临床前瞻性试验，验证系统的可靠性和准确性，期望根据数学模拟对脓毒症免疫状态进行定量评分（即免疫功能指数，immune function index）和动态监控，以便早期、敏感、有效地反映病情的变化和临床结局。

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