趋化因子受体CCR7在胃癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达情况及其与肿瘤的相关研究

[摘要]目的 检测胃癌患者术前、术后外周血中CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体(chemokine receptor)CCR7的表达情况，探讨CCR7在胃癌的发生、发展及浸润转移过程中的作用。方法 利用流式细胞仪检测每一例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测趋化因子受体CCR7的阳性表达率。比较胃癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况；比较胃癌患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7表达阳性率变化。结果 胃癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率与正常人比较差异有显著性意义（P＜0.05），可以认为正常对照组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比患者组高；术前组与术后组比较差异有显著性意义（P＜0.05），可以认为胃癌患者术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高。结论 CCR7在胃癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上高度表达，并与胃癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的密切相关；CCR7的表达可能与促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质有关。

关键词：CCR7 抗肿瘤效应 肿瘤转移 趋化因子 流式细胞术

Research on the Expression of Chemokine C Receptor 7 On the Peripheral Blood CD3+CD8+T Cells of Patiences With Gastric Cancer and Its relationship with Tumour Xu Yu-gang ,Cui gang,Cheng ming

【Abstract】Objective The research is to investigate the expression of Chemokine C Receptor 7 on the peripheral blood CD3+CD8+T cells of patients with gastric cancer before and after the operation, analyse the relativity among the expression of CCR7,the pathology differentiation extent of gastric cancer, the size of tumour and the clinical stage, and then to discuss the function of CCR7 in the process of the occurrence and development, the invasion and metastasis of gastric cancer.Methods Flow Cytometer is used to examine the peripheral blood of every patience and CELLQuest is used to obtain and analyse CD3+CD8+T cells and also examine the masculine expressive rate of CCR7. The research also compares the expression of CCR7 on the peripheral blood CD3+CD8+T cells of patients with gastric cancer with that of normal controls, the preoperative and postoperative masculine expressive rate of CCR7 of the patients with gastric cancer on the peripheral blood CD3+CD8+T cells.Results There are significant differences between the masculine expressive rate of CCR7 of the patients with gastric cancer on the peripheral blood CD3+CD8+T cells and that of the normal control (p

Key Words：CCR7 ; Anti-tumour effect ; Tranfer of Tumour ; Chemokine C ; Flow Cyto-method

中图分类号：R735 文献标识码：B 文章编号：1004-7484(2011)16-0032-05

胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，也是消化系统发病率最高的肿瘤。我国是胃癌的高发区，易发年龄多在50～70岁之间，但近年来胃癌却有“年轻化”趋势。发病年龄在40岁以下的病患不在少数。另外，社会阶层较低的人群患胃癌的几率比高阶层者略高，所以约有1/3的患者发现治疗时已是晚期。早期发现、早期诊断、早期治疗是改善胃癌预后的主要手段。自上个世纪80年代以来，人们开始在胃癌患者外周血寻找肿瘤标志物，以期能够早期诊断胃癌。但是由于胃癌临床的异质性表现，迄今为止尚缺乏有效理想的肿瘤标志物，因此给胃癌临床早期诊断、术后疗效评价、预后监测等造成了一定的困难。目前已发现的胃癌相关标志物有癌胚抗原和糖链抗原CA19-9、CA125和CA50等，但是这些指标敏感性和特异性均很低，尚不足以用于进行早期诊断。因此，寻找敏感性、特应性高的胃癌标志物以提高胃癌的早期诊断、疗效评价和预测预后尤为重要。本实验就是利用流式细胞仪技术检测趋化因子受体CCR7在胃癌患者术前术后外周血记忆型T细胞亚群上的表达情况，并与正常人相对照，并通过与肿瘤免疫逃逸有关的表面抗原以及细胞因子等的检测，为胃癌临床标志物的筛选、胃癌发病机制的探讨以及胃癌的综合防治提供有价值的线索。

1 材料和方法

1.1试剂和仪器

FACScaliur流式细胞仪：美国BD公司

KDC-160HR低温高速离心机：科大创新中佳分公司

可调式微量移液器：德国eppendrof公司

CELLQuest获取和分析软件：美国BD公司

鼠抗人CD8-FITC、CD3-PE-cy5、CCR7-PE单克隆抗体均购自美国BD公司

0.5M EDTA、PBS缓冲液、溶血素、Falcon管、15ml离心管、Tip头及其他常规试剂与耗材均为国产

1.2标本来源及分组

44例胃癌患者为泰安市中心医院2010年4月～2011年5月住院病人，其中男性34例，女性10例，年龄45～74岁，平均年龄57岁。阴性对照组44例选自我院健康查体者，经胃镜取材并经病理证实无胃部疾病。其中男性32例，女性12例，年龄34～84岁，平均年龄59岁。

1.3标本的留取及制备

术前2天清晨空腹抽取肘静脉血2ml置EDTA抗凝无菌试管中送中心实验室做流式检测CCR7表达情况。术后7天后再次抽血检测，并查看病人病理情况。按表1记录病人情况：

表1 临床病例登记信息表

编号 姓名 性别 年龄 住院号 籍贯 家族史 饮食

习惯 临床

诊断 病理号 病理

描述 临床

分期 CEA CA19-9 CA242

1

2

3

1.4研究方法及操作步骤

①加入标本血。收集胃癌患者术前、术后以及正常人外周血，分离PBMC后，在Falcon管中各加入5ulPE、5ulPE-Cy5和10ulFITC标记的抗体，每管加入50ul细胞悬液（5×105），充分混匀后，室温避光孵育15min。同时设同型阴性对照管，只加入50ul细胞悬液。

②加入溶血素，室温避光8min。

③1000r/min离心5min，弃上清，再加入0.9%生理盐水4ml混匀。

④重复步骤③。

⑤1000r/min离心5min，弃上清，加入500ul生理盐水，上机检测。

⑥流式细胞仪检测结果，以CELLQuest软件获取细胞，设立同型阴性对照，调整电压，设立淋巴细胞门，检测淋巴细胞数量和CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率。

1.5技术路线

图1 标本上机检测前的处理路线

图2 某例胃癌患者外周血中淋巴细胞流式分析时设立同型阴性对照

1.6检测及数据采集

利用流式细胞仪检测每一例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测趋化因子受体CCR7的阳性表达率。数据检测见图3，数据采集见表2。

a b

c d

图3 某例胃癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7流式分析效果图

表2 部分胃癌患者术前、术后及正常人外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7表达情况（%）

编号 术前 术后 正常

1 8.90 10.35 76.69

2 20.07 10.96 67.75

3 21.38 41.59 67.68

1.7实验结果的统计学分析

采用ANOVA方差分析，以SAS9.0统计软件对实验结果进行统计学分析。比较胃癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况；比较胃癌患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7表达阳性率变化。

2 结果与分析

三组间采用ANOVA分析，F=10.13 ，P＜0.0001；术前组与术后组比较（P＜0.05)，有统计学意义，可以认为胃癌患者术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高；正常对照组与胃癌患者组比较（P＜0.05)，有统计学意义，可以认为正常对照组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比患者组高，各级均数、标准差及均数直方图如下：

表3 胃癌患者组与对照组CCR7阳性表达率检测结果比较

组别 例数 CCR7表达率（%）

术前组（1）

术后组（2）

正常组（3） 44

44

44 41.84±23.83

52.33±29.90

63.78±10.40

经方差分析，各组比较F=10.13 ，P＜0.0001

（1）与（2）比较，P＜0.05；

（1）与（3）比较，P＜0.05；

（2）与（3）比较，P＜0.05。

图4 外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7表达均数直方图

图中横坐标代表标本分组，纵坐标代表CCR7阳性表达率，

术前组

3 讨论

趋化因子(chemokine)是一类由不同类型细胞分泌的低分子量（8～12kd)的细胞因子，其生物学功能主要是使细胞发生趋化运动的，在淋巴细胞的定向迁移，造血细胞、免疫细胞的发育和分化，炎症的发生，血管的生成及肿瘤的发生中分别起着不同的作用。趋化因子功能的发挥需要由趋化因子受体(chemokine receptor)来介导。趋化因子与其受体的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统和组织器官间定向迁移。趋化因子受体和其配体结合后，不仅可以参与细胞的生长、发育、分化、凋亡和分布等多种生理功能，而且在多种如炎症反应、损伤的修复、肿瘤的生长和恶化等病理过程中发挥重要作用[1]。CCR7是一类新发现的趋化因子受体，目前发现CCR7与其配体CCL19和CCL21结合后，在肿瘤生长和转移中起着令人瞩目的作用。我们就从CD3+CD8+T细胞着手，研究CCR7在CD3+CD8+T细胞上的表达及其与抗肿瘤效应、细胞凋亡、在恶性肿瘤转移方面的作用。

目前发现CCR7与其配体CCL19和CCL21结合后，在肿瘤生长和转移中起着令人瞩目的作用。在淋巴结中CCL19和CCL21的表达都很丰富，CCL21的表达量相对更高，提示CCL21在淋巴细胞的归巢中起着更重要的作用[2]。免疫反应的产生首先由抗原提呈细胞(APC)捕获抗原，经加工、处理后将信息传递给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的特异性免疫应答。因此，APC是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原提呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导。而DC是功能最强的抗原提呈细胞，在肿瘤免疫应答的诱导中具有独特的地位，其中DC从肿瘤部位到淋巴组织的迁移是关键的一步。研究发现DC在迁移成熟的过程中表达CCR7的量逐渐增多[3]；CCR7基因转染DC后能有效促进DC向淋巴结的迁移，当DC与凋亡的纤维肉瘤细胞共培养后，观察到24小时内DC从肿瘤部位向引流淋巴结迁移，并检测到CCR7的表达增高，而区域淋巴结中SLCmRNA增高[4]，因此认为CCR7及其配体在诱导DC的抗肿瘤免疫反应中起重要作用。

转移是恶性肿瘤最基本的特征之一，是一种非随机的、有组织器官选择性的高度组织化的过程，与淋巴细胞的定向迁移有相似之处。越来越多的证据表明，肿瘤的转移是嗜器官的。趋化因子及其受体在肿瘤的生长、转移中发挥重要作用。趋化因子与相应受体结合可引起细胞内肌动蛋白的聚合，后者与肿瘤细胞的伪足形成有关，是肿瘤细胞浸润、转移所必需的。CCR7表达与淋巴管浸润和淋巴结转移的密切关系已见于非小细胞肺癌、食管鳞癌和胃癌、黑色素瘤[5，6]。

最近有人描述了CCR7在成熟树突状细胞中的新作用，提出CCR7可以传递信号，从而通过磷酸肌醇激酶-3/Akt途径抑制成熟树突状细胞凋亡[7]。除此之外，CCR7及其配体CCL21参与肾小球系膜的分裂繁殖，肾细胞凋亡以及组织的静态平衡[8]。总之，这些研究表明CCR7影响包括淋巴细胞在内的各种细胞的生存，因此抗细胞凋亡信号的传送是一个重要机制。

本实验仅研究了胃癌患者外周血中CD3+CD8+T细胞上CCR7的表达情况,我们将收集更多的病例,并利用SELDI技术对胃癌患者术前、术后的血清蛋白质组学进行研究，并且与正常对照组进行比较。获得胃癌患者术前、术后的血清蛋白质组学图谱，寻找差异表达的蛋白质和肿瘤标志物，为胃癌的早期诊断、术后疗效评价、预后监测等提供重要的实验依据。

参考文献

[1] Crazzolara R,Bernhard D. CXCR4 chemokine receptors, histone deacetylase inhibitors and acute lymphoblastic leukemia[J]. Leuk Lymphoma,2005,46(11):1545-1551.

[2] Stein JV,Soriano SF,Mrini C,et al.CCR7-mediated physiological lymphocyte homing involves activation of a tyrosine kinase pathway[J].Blood,2003,101(1):38.

[3] Sallusto F,Lanzavecchia A.Understanding dendritic cell and T-lymphocyte trafficthrough the analysis of chemokine receptor expression[J].Immunol Rev，2000，177:134-140.

[4] Motohiro Hirao,Nobuyuki Onai,Kazumasa Hiroishi,et al.CC chemokine receptor-7 on dendritic cells is induced after interaction with apoptotic tumor cells:critical role in migration from the tumor site to draining lymph nodes[J].Cancer Research,2000,60(8):2209-2217.

[5] Hiroya T, Akihide F, Maki T, et al. CCL21 chemokine regulates chemokine receptor CCR7 bearing m alignant melanoma cells[J]. Clin Cancer Res,2004,(10):2351.

[6] Wiley HE, Gonza EB, Maki W, et al.Expression of CC chemokine receptor 7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma[J]. J Natl Cancer Inst,2001,93(21):1638.

[7] Sanchez-Sanchez N, Riol-Blanco L, de la Rosa G, et al. Chemokine receptor CCR7 induces intracellular signaling that inhibits apoptosis of mature dendritic cells.Blood 2004;104:619-25.

[8] Banas B,Wornle M,Berger T, et al. Roles of SLC/CCL21 and CCR7 in human kidney for mesangial proliferation,migration,apoptosis,and tissue homeostasis.J Immunol 2002;168:4301-7.