一起家庭内HIV-1感染的分子流行病学研究

摘要：［目的］采用现场流行病学和分子流行病学相结合的方法，以阐明家庭内成员HIV-1病毒传播关系。［方法］通过定性流行病学，调查一家庭内各成员有关HIV-1感染及其相关因素，并应用巢式RT-PCR扩增HIV-1 pol区和env区基因，经DNA测序后用遗传进化系统树比对的方法，结合现场调查资料进行综合分析。［结果］该家庭中3人HIV感染毒株亚型均为CRF 07-BC。3个病例毒株的基因同源性高达99％和98％，且克隆基因差异较小，父母之间的基因克隆进化关系成立，但父子之间的进化关系明显大于母子的关系。3人与耐药相关基因突变位点分布情况基本一致，但在A71T位点上的突变率以儿子最高（100％），父亲其次（83％），母亲则未发生突变。［结论］该家庭中母亲是感染了父亲的部分尚未发生变异的病毒株，儿子则感染了父亲体内的变异株，初步提示为家庭内个人密切接触的HIV感染。

关键词： HIV-1；家庭内感染；流行病学中图分类号： R 512.91文献标识码：Ａ

众所周知，HIV-1是通过性接触、血液（针刺吸毒或使用血液及血液制品）以及母婴途径传播。绝大多数研究发现，家庭内的密切接触与HIV-1病毒的感染无关［1~4］。但是有报道证明了一些特殊的情况也可造成HIV-1病毒的传播［5~8］，包括可能有家庭内的传播［9~13］。本次研究特别关注1例无性接触、明显的血液接触和母婴途径而感染HIV-1的病例，并运用分子流行病学的证据证明病毒是从家庭内1位成员传播而来。

1材料与方法

1.1流行病学调查

在知情同意的前提下，对一感染HIV-1的家庭中3位成员进行咨询访谈。调查内容主要包括调查对象的人口社会学特征、感染HIV的可能途径、发病的症状和治疗情况等。

1.2实验室检测

3位病人的血样在采集后24 h内送往本中心实验室，实验测定项目包括CD4细胞计数、HIV-1病毒载量检测、基因亚型分析和耐药突变测定。

1.2.1CD4＋淋巴细胞计数流式细胞仪(美国BECTON DICKINSON公司)测定CD4、CD8、CD3 T淋巴细胞绝对值。将20 μL CD4/CD8/CD3 TRITEST试剂加入CD4绝对计数管中，加入50 μL 抗凝血，室温避光15 min，加入免洗溶血素450 μL ，室温避光15 min，用FACSMULTISET软件检测并进行自动分析。

1.2.2病毒载量测定采用核酸序列扩增实验（Easy Q NASBA）。严格按试剂说明书操作。

1.2.3基因亚型和耐药位点突变分析

① 血浆HIV-1 RNA 提取：使用离心柱吸附RNA分离方法（QIAamp viral RNA mini kit，QIAGEN）提取RNA，-80℃冻存。

② HIV-1 RNA 逆转录巢式PCR（RT-PCR）：使用RNA逆转录和PCR一步法扩增试剂（Titan One Tube RT-PCR System, Roche Diagnostics GmbH，Germany）和PCR扩增试剂（Expand High Fidelityplus PCR System, Roche Diagnostics GmbH，Germany）。

③ RT-PCR逆转录扩增反应：pol区引物SHP1(5’-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’, HIV-1 HBX2, 2027-2050)和SHP2(5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG -3’ , HIV-1 HBX2, 3509-3539),env区引物ED5和ED12［14］，各0.5 μL (20 mmol/L), MgCl2 1.5 μL(25 mmol/L), 5x缓冲液 5 μL, dNTP混合液0.5 μL(10 mmol/L), DTT 1.25 μL，RNA酶抑制剂 0.25 μL，酶混合物 0.5 μL(5 U/μL), DEPC水12 μL, RNA模板3 μL，反应终体积为25 μL。反应条件为：48℃ 45 min,94℃ 2 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,68℃ 2.5 min,35个循环；68℃ 延伸10 min，4℃保温(热循环仪, GeneAmpPCR System 9700, Applied Biosystems)。

④ 第二轮PCR扩增： pol区引物SHP3（5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’，HIV-1 HBX2, 2147-2166）和SHP4 (5’-CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT-3’，HIV-1 HBX2, 3326-3330），env区引物ES7和ES8［14］,各1 μL(20 mmol/L),5x 缓冲液10 μL, MgCl2 3 μL(25 mmol/L), dNTP混合液1μL(10 mmol/L)，DNA聚合酶0.5 μL（5 U/μL）,DEPC水28.5 μL，第一轮PCR产物5 μL,反应终体积50 μL。 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 5 s,55℃ 30 s,72℃ 2.5 min,35个循环；72℃ 10 min 延伸,4℃保温。

⑤ 基因克隆：采用TOPO TA Cloning（Invitrogen公司）。严格按试剂说明书操作。

⑥ 电泳：1%琼脂糖(BioDev, Uniche Co.Ld USA)凝胶电泳,每个样本5 μL，使用1kb DNA梯度对照 (New ENGLAND, Biolabs)，电泳条件为100 v，45 min(电泳仪,BIO-RAD Power PAC3000，USA)，PCR扩增产物片段约1.2 kb。电泳结果经凝胶成像仪拍照存档(凝胶成像仪ImageMaster VDS-CL，Amersham Pharmacia Biotech)。

⑦ PCR扩增产物的纯化和核苷酸序列测定： PCR扩增产物由上海英骏生物技术有限公司纯化和测序，使用3730XL测序仪(Applied Biosystems,Forester City, CA)，用PCR扩增引物pol区SHP3和SHP4以及测序引物SHP5（5’-GTTGACTCAGATTGGTTGCAC-3’，HIV-1 HBX2, 2519-2539）和SHP6（5’-CCCTGCTGGGTGTGGTATTCC-3’，HIV-1 HBX2，2826-2846），env区ES7和ES8，进行双向测序。

⑧ 序列分析：使用Gene Runner、CLUSTAL X、Seaview、ContigExpress等软件进行序列的排列、比较和编辑，用TREECON 软件（Treecon for Windows，version 3.1）与国际参考HIV-1序列进行系统树分析以确定基因亚型，并用Neighbour-joining软件分析各病毒基因之间的进化关系［15］。

⑨ 耐药性分析: 应用美国斯坦福大学HIV耐药数据库（Stanford University HIV DRUG RESISTANCE DATABASE）进行耐药性分析［16］。

1.3数据分析

应用统计分析软件 SAS 9.0进行数据分析。

2 结果

2.1病例报告

3个病例分别为同一家庭中的父亲、母亲和儿子。流行病学调查情况如下：

病例1：男，56岁，退休干部。2006年9月27日因出现间断性发热1年，并伴有颈部淋巴结肿大，经上海市疾病预防控制中心确证HIV阳性。患者否认手术史、输血史、吸毒史。1991年在云南出差时曾经历过多次未使用安全套的。与妻子发生时也从未使用安全套。患者于2006年10月13日因艾滋病合并颅内占位性病变死亡。死亡前HIV病毒载量为950 000 copies/mL，CD4淋巴细胞计数为9个/mL，未接受抗病毒治疗（HARRT）。

病例2：女，53岁，护士。为病例1的妻子和病例3的母亲。因其丈夫患AIDS死亡，而于2006年10月21日体检,确诊HIV阳性。患者未出现发热、消瘦等症状，为HIV感染者。与其丈夫过正常性生活，从未使用安全套，最后一次发生于其丈夫2006年9月确诊前的半年内。无受血/血制品史，无婚外性伴，无吸毒史，无手术和拔牙史，无职业性暴露史。2006年10月28日检测CD4为 419个/μL，HIV病毒载量为21000 copies/mL。

病例3：男，26岁，软件工程师，未婚。为病例1和2的亲生儿子。2006年10月21日与其母亲一同进行体检并确认HIV阳性。此前未出现发热、消瘦等症状，为HIV无症状感染者。患者否认有性生活史、吸毒史、采供血史、非性职业暴露史、手术史，和父亲平时也无明确的伤口接触史。2006年10月28日检测CD4 为659个/μL，HIV病毒载量为18 000 copies/mL。

2.2HIV-1亚型分析

对HIV-1 pol区和env区基因经扩增测序，并与国际上HIV-1亚型数据库中所有已知亚型和重组体比对分析，发现3例病人均为CRF07_BC (图1,2)。

2.3遗传进化系统树比对分析同源性

选取3个病例在pol区的基因克隆（分别对病例1、病例2和病例3各选18个、12个和14个克隆）进行测序，并建立遗传进化系统树进行比对分析，发现这3个病例的病毒克隆基因起源于共同祖先。用Neighbour-joining方法分析后发现三者之间同源性值高达99％，同时它们又与上海CRF-07-BC病毒株的同源性为86%，均比其他亚型标准株基因同源性高。其次，发现在遗传进化系统树上每个病例的克隆基因分别相对独立成簇，病例2的12个克隆基因与病例1的以及病例3与病例1的克隆基因关系都十分密切。病例1的2个克隆株（f 9与f 1）与病例3的克隆基因群有进化关系，但未见病例2和病例3克隆基因群之间有明显的进化关系（图1）。

同时，在env区分别选取3个病例的基因克隆，其中病例1选11个，病例2选7个，病例3选6个，经扩增和测序并进行遗传进化系统树比对分析发现，3个病例的病毒克隆基因也起源于共同祖先，并且3组克隆相对独立成簇，三者之间同源性为98％，结果与pol区基本一致。同时，病例1也存在2个克隆株（10EF与10DF）与病例3的克隆基因群有进化关系，但是仍然未见病例2和病例3克隆基因群之间有明显的进化关系（图2）。

2.4env区和pol区克隆基因差异性比较

每个病例克隆之间的基因差异性比较，无论在env区还是在pol区，都是病例1基因变异差异性最高,病例2其次和病例3最低；在env区分别为4.39％、2.06％和1.54％，在pol区分别为1.15％、1.04％和0.42％。

3个病例之间的克隆基因差异性比较，在env区和pol区都以病例1和病例3之间的差异最小，分别为（6.05±0.85）％和（1.57±0.12）％，其次为病例1和病例2之间，分别为（6.86±0.93)％和（1.91±0.14）％，最大差异为病例2和病例3之间，分别为（7.80±1.08）%和（2.22±0.33）％。

2.5pol区中与耐药相关基因突变位点分布情况

3个病例都发生了与耐药相关的基因位点突变，而且分布情况基本一致。虽然与耐药相关基因突变均未出现在主要位点，但是在部分次要位点（T12A、E35D、R41K和I93L）所有克隆均发生基因突变，在L33i、E34D、D60Xi、I62i、I64X和W83i等位点上也有92%～94％出现与耐药相关基因突变位点。同时，与耐药相关基因突变位点三者出现明显的不同，在A71T病例3出现均的突变，病例1为83%，而病例2则没有发生变异。

3讨论

25年来的流行病学调查研究确定了HIV-1的主要传播途径，在成人以性接触和血液接触为主，在儿童感染以母婴传染为主。但是近些年来，一些在家庭内HIV感染的病例报告屡见不鲜。依据以往绝大多数家庭内感染的案例分析发现，HIV病毒往往从家庭内夫妻间已被感染的一方通过性接触途径传染给另一方，然后再从母亲经母婴传播方式感染孩子。本次研究的病例1、2、3分别为同一家庭中的父亲、母亲和儿子。根据流行病学调查，发现父亲曾在1991年有过无保护性的婚外，这有可能导致HIV的感染。病例中的母亲排除了经血/血制品史、婚外恋和吸毒的可能性，也没有手术和拔牙史以及职业暴露史，唯一只可能经与其丈夫的性接触而感染。至于病例中的儿子，出生于1981年，基本可以排除在出生时母婴途径感染的可能。同时，根据流行病学史其否认有性生活史、吸毒史、采供血史、手术史等可能感染HIV的途径，因此儿子的HIV感染方式和途径就特别值得关注。

本次研究拟通过分子流行病学的分析方法，来推断其感染HIV的来源。首先，经基因测序和遗传进化系统树比对分析结果，3个病例的病毒株均为CRF07_BC亚型，证明三者起源于共同祖先。特别是父亲pol区的2个克隆株（f 9与f 1）和env区的2个克隆株（10EF与10DF）与儿子的克隆基因群有明显的进化关系，这就更加明确地显示父亲与儿子间病毒的传染关系。其次，近期研究发现，病毒株之间的进化关系可以通过基因组的比对观察差异性的大小而得到，差异性越小进化关系越近。这次3个病例之间的克隆基因差异性比较，在env区和pol区都以父亲和儿子之间的差异最小，最大差异为母亲和儿子之间，说明父亲与儿子病毒株的进化关系更近，儿子从父亲比从母亲感染病毒的可能性更大。再者，病毒株克隆之间的基因差异性大小说明该病毒株进化时间的长短，越是近期感染的病毒株，其基因差异性越小。观察3个病例的基因区段，无论在env区还是在pol区，都是以父亲的克隆基因之间差异最高、母亲其次和儿子最低。三者的感染时间顺序为父亲、母亲、儿子。特别是儿子的变异数比较小，近期感染的可能性比较大，完全可以排除母婴传播的可能性。

在pol区中与耐药相关基因突变位点，3个病例都发生而且分布情况基本一致。应当注意的是，与耐药相关基因突变位点三者也出现了明显的不同，在A71T儿子出现100％的突变，父亲为83%，而母亲则没有发生变异。分析这一现象，可能是由于父亲感染时间较长，病毒株在其体内发生变异所致。母亲是感染了父亲体内的在该位点发生变异之前或部分尚未发生变异的病毒株，而导致与耐药相关基因突变位点A71T未产生变异。同时，儿子则感染了父亲体内的变异株，从而在A71T位上产生变异，由此可进一步阐明父子之间的传播关系。

以往对HIV感染者的感染途径主要根据其自述来推断，往往无法确定感染的真实来源。本次研究运用分子生物学与传统流行病学相结合的研究方法，报告了HIV在家庭内成人间通过非性或非明显的血液途径而传染的可能性。在上述的研究结果中，从病毒的亚型确定、基因同源性比对、克隆基因差异性比较和与耐药相关基因突变位点分析，基本推断儿子感染的HIV病毒的传播源来自于父亲，并且完全可以排除母婴传播的可能。但是，目前无法明确解释病毒究竟在何时通过何种方式和途径从父亲感染给儿子，尚需进一步的流行病学调查研究。

综上所述，运用流行病学调查资料并结合分子生物学方法来综合分析HIV的感染途径，能更明确地揭示病毒的传播规律，从而更有效地控制艾滋病的传播。

（对帮助完成本研究项目的潘启超、方蕙、庄鸣华、徐明珠、岳清、高咸明、张玮、王盈、沈方伟、郑子佳等同志表示衷心感谢）

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(收稿日期：2007-05-17)

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”