腺病毒介导外源基因经动脉转染大鼠腹壁浅动脉岛状皮瓣的研究

[摘要]目的：探讨腺病毒载体介导外源基因经动脉灌注转移修饰大鼠腹壁浅动脉岛状皮瓣（Superficial inferior epigastric artery flap，SIEA）的可行性、安全性并对其转染条件作出评价。方法： 本研究通过血管夹暂时夹闭形成局部封闭环境，应用腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因 (Ad5-CMV-EGFP) 经动脉灌注带蒂SIEA 60min。60只SD大鼠随机分为6组： A、B、C、D组分别为：3.0×106、3.0×107、3.0×108、3.0×109pfu/ml，E组：PBS、F组：腺病毒空载体。术后7天应用活体荧光成像系统观察皮瓣的荧光强度，应用共聚焦显微镜、RT- PCR检测皮瓣组织中EGFP的表达和分布情况，通过组织学分析对皮瓣的安全性影响。结果：术后7天B组、C组、D组活体观察皮瓣可见体表绿色荧光信号。共聚焦显微镜观察结果与活体观察结果一致，EGFP在皮瓣内血管内、外膜均可见表达，血管周围组织包括脂肪、毛囊可见EGFP表达，皮瓣外组织未见EGFP 表达。对照组E组、F组未见EGFP表达。RT-PCR结果显示，EGFP仅在皮瓣内表达，其他重要脏器（心脏、肝脏、肾脏）无表达。对皮瓣组织学观察未见明显炎症反应。结论：复合组织瓣转移修复创面是一种成熟的手术方式。本研究从大体观察、组织形态学和分子生物学三方面评价外源基因经动脉内灌注转染大鼠带蒂皮瓣的可行性,为进一步深入研究基因修饰复合组织瓣，使其发挥治疗性修复创面作用提供理论依据

[关键词]腹壁浅动脉皮瓣；外源基因；经动脉灌注；腺病毒

[中图分类号]Q343.6[文献标识码]Ａ[文章编号]1008-6455（2009）02-0197-05

Adenovirus mediated exgenous gene transfect rat's SIEA flap by intra-artery perfusion

LI Dan，QIAO Qun，WANG Xiao-jun，ZENG Ang

（Plastic & Aesthetic Surgery Center, Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College, Beijing 100032,China）

Abstract:ObjectiveTo study the feasibility of superficial inferior epigastric artery (SIEA) flap transfected by intra-artery perfusion with exogenous gene mediated by adenovirus, and assess the transfect efficiency and optimal conditions.Methods： In our study ,rat's SIEA flap is transfected by intra-artery perfusion with exogenous enhanced gene-green florescent protein mediated by adenovirus (Ad5-CMV-EGFP) for 60 min . 60 Sprague Dawley rats were randomly divided into 6 groups: A (3.0×106pfu/ml), B(3.0×107pfu/ml), C (3.0×108pfu/ml), D(3.0×109pfu/ml), E(PBS), F(Adenovirus),and assess the transfect efficiency and optimal conditions. Under the optimal conditions, various components of SIEA flaps and the expressions of exogenous genes in adjacent tissue are observed to evaluate the effects of this transfect model to the whole system. At the 7th day of post operation, EGFP expression in tissue was detected by IVIS Imaging System, laser scanning confocal microscope and RT-PCR .Histological evaluation was used to assess toxicity.Results:The expression of EGFP was detected by IVIS Imaging System in group B, group C, group D at the 7th day of post operation. The result detected by fluorescence microscopy was similar to IVIS Imaging System. Ad5-CMV-EGFP.EGFP expression was comfirmed in the flap's intima, and perivascular tissue including adipose tissue, follicles. The result of RT-PCR shows that the sequence of EGFP is observed in flap, but no EGFP was observed in heart、liver or kidney. Histological evaluation of the flap revealed no evidence of inflammation in the treated group.ConclusionWound reconstruction by using microvascular flaps is a mature measure in plastic surgery. In this research, the author study the feasibility to transfect exogenous genes to rat's pedicle by intra-artery perfusion. By doing this, we can further study the genetically modified microvascular pedicle flaps ,and provide theoretic references for applying pedicle composite tissue flap to perform therapeutic and reconstructive functions.

Key words：superficial inferior epigastric artery(SIEA) flap; exogenous gene; intra-artery perfusion; adenovirus

复合组织瓣在难愈创面及体表肿瘤切除后的修复重建过程中发挥重要作用。通过对复合组织瓣进行基因修饰等手段而达到基因治疗的目的,是目前整形外科的研究热点之一。有稳定血管供应的复合组织瓣是良好靶组织，其微血管床是基因经动脉灌注转染的理想模型。动脉内灌注目的基因高效转染修饰局部组织，使其表达治疗蛋白，在移植医学及介入医学领域已有报道[1]，但在整形外科领域报道较少。本实验利用大鼠带蒂腹壁浅动脉皮瓣（Superficial inferior epigastric artery flap，SIEA）动物模型，探讨腺病毒载体介导外源基因（Ad5-CMV-EGFP）经动脉介入灌注转染复合组织瓣的可行性、安全性并对其转染条件做出评价。

1材料和方法

1.1腺病毒载体：Ad5-CMV-EGFP 为含巨细胞病毒启动子(CMV) 的编码增强型绿色荧光蛋白( EGFP) 基因的血清5 型重组腺病毒载体,由北京本原正阳基因技术有限公司提供,腺病毒滴度为9×109pfu/ml，实验前用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释成滴度为3.0×106pfu/ml、3.0×107pfu/ml、3.0 ×108pfu/ml、3.0×109pfu/ml溶液备用。

1.2 实验动物：健康SD大鼠48只，雄性，体重0.35～0.40kg，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于北京协和医院实验动物中心，饲养条件SPF级。实验动物被随机分为6组，每组8只，A组：3.0×106pfu/ml，B组：3.0×107pfu/ml，C组：3.0×108pfu/ml，D组：3.0×109pfu/ml，E组：PBS，F组：腺病毒空载体。

1.3 基因经动脉转移至SIEA皮瓣动物模型制备：应用戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射大鼠麻醉成功后，腹股沟和腿部备皮，应用标记笔在腹股沟动脉搏动点处设计1.5cm×1.5cm 大小皮瓣，并设计向下肢延伸约2cm长切口线（图1）。依次剪开皮肤及皮下组织，深达腹肌肌膜表面，即皮瓣由皮肤和肉膜组成，形成以腹壁浅动静脉为单一血供的带蒂SIEA皮瓣（图2）。随后在腹壁浅动静脉根部分离股动静脉，应用血管夹夹闭股动脉发出腹壁浅动脉根部周围的分支及股动、静脉，暂时阻断皮瓣血运，在腹壁浅动、静脉分支处以远0.5cm处将微套管针插入股动脉，应用血管夹固定股动脉与套管针后，套管针接口端接微量灌注泵。皮瓣首先用5mlPBS通过动脉灌注，同时保持股静脉近心端不被钳夹状态，可以使血液从皮瓣血管床中排出。将皮瓣放入无菌培养皿，以温盐水纱布衬垫，将Ad5-CMV-EGFP 0.5ml注入1ml注射器，接微量灌注泵，以120mmHg压力开始进行灌注时，将股静脉近心端应用血管夹夹闭，使皮瓣保持局部封闭状态，以温盐水纱布包裹皮瓣，孵育60min后，释放套管针插口处血管夹，应用11-0丝线间断对合缝合股动脉残留插口，随后释放腹壁浅动静脉血管蒂周围全部血管夹，使腹壁下动脉皮瓣恢复正常血供。原位分层缝合肉膜及皮肤组织。

1.4 标本采集及检测指标：术后第7天，从大体观察、组织形态学和分子生物学三方面评价外源基因在对A、B、C、D、E、F6组SD大鼠带蒂SIEA皮瓣的表达和分布情况[2]。

1.4.1 活体检测：将各组SD大鼠分别应用戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉成功后，腹股沟及下肢应用电动剃毛器备皮，放入活体荧光成像系统（IVIS，USA）,大体观察SIEA皮瓣绿色荧光蛋白表达情况并拍照，应用living image 3.0图像分析软件得出绿色荧光蛋白荧光强度。

1.4.2 标本采集后检测：活体检测后实验鼠均应用过量戊巴比妥腹腔注射处死，快速切取皮瓣组织，自中央剖开，一部分组织经液氮速冻放入-80℃冰箱保存，用于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测，另一部分组织OCT 包埋后立即放入液氮中速冻后，应用恒冷箱冰冻切片机（Leica，CM1900）切成10μm切片，-80℃保存,用于荧光显微镜观测，冰冻切片剩余组织放入4%多聚甲醛溶液固定24h，石蜡包埋后，应用石蜡切片机（Leica，RM2145）切成7μm切片，行HE染色后光镜检测。

1.4.2.1 共聚焦显微镜观察：激光共聚焦显微镜（Leica，TCS SP2）检测EGFP表达及分布情况，扫描分辨率为1024×1024 pixel,计算机数据采集，数字成像。应用IPP6.0图像软件计算灰度值。

1.4.2.2 RT-PCR检测：Purescript RNA提取试剂盒(Gentra，USA)提取皮瓣组织中总RNA，然后用RT-PCR试剂盒(Gentra，USA)一步法检测RNA样品中的EGFP基因表达水平。应用软件设计引物，正义引物5'TGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT3'，反义引物5'TGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGC3'，扩增长度555bp(上海生工公司合成)。将提取的1μg总RNA样品和RT-PCR试剂盒中试剂混合，建立50μl 的RT-PCR反应混合体系，在PCR仪(Biometra)进行反应，取10μlPCR产物上样，1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪(Tanon)检测RT-PCR结果并拍照。

1.4.2.3 光镜观察：应用倒置显微镜（Leica，MPS 30）观察HE染色切片中皮瓣组织结构及炎性细胞浸润情况。

1.4 统计学处理：实验所得数据采用SPSS13.0统计分析软件进行分析，应用t检验检测组间差异，并以均数±标准差( x±s)表示，P

2结果

2.1 大体观察：术后第7天，48只SD大鼠中2只出现皮瓣自噬现象，从实验中剔除。B组、C组、D组通过活体成像系统观察皮瓣可见体表绿色荧光信号，其中D组绿色荧光信号最为明显。A组、E组、F组未见体表绿色荧光信号，表明腺病毒空载体（F组）、PBS（E组）和过低滴度的3.0×106pfu/ml Ad5-CMV-EGFP（A组）均无法正常表达EGFP（表1）。

2.2 共聚焦显微镜观察：术后7天，对照组E组、F组SIEA皮瓣中未见明显自主荧光物质。B 组、C组、D组共聚焦显微镜下可见EGFP信号，其中D组（Ad5-CMV-EGFP 3.0×109pfu/ml）在SIEA皮瓣组织的所有类型细胞中EGFP基因均有表达，内皮细胞有最好的转染表达量，在动脉的内膜层可见强烈的绿色荧光，外膜层可见。紧邻血管外的细胞可见EGFP表达，表示经血管灌注的Ad5-CMV-EGFP从血管内逸出，并能够扩散至邻近的实质组织中，多数内皮细胞可以有效的转染（＞90%），肉膜中肌细胞（40%），脂肪细胞（30%），角质细胞及毛囊细胞（20%）（图3）。与Ad5-CMV-EGFP高滴度（3.0×109pfu/ml）且EGFP表达最为明显的D组相比，A组在Ad5-CMV-EGFP 3.0×106pfu/ml滴度，未见明显EGFP表达。

2.3 RT-PCR 检测：转染后7天， D组SIEA皮瓣组织样品可见在500～700bp之间有1条清晰泳带，约550bp，与Ad5-CMV-EGFP 质粒组的EGFP cDNA 大小相一致，说明经动脉灌注Ad5-CMV-EGFP转染SIEA皮瓣组织后7天，EGFP 基因在mRNA 水平有表达，而在皮瓣周围组织未发现EGFP基因表达。另外D组随机取2只SD大鼠的肝脏、心脏和肾脏组织经RT-PCR 检测均未见EGFP mRNA 的表达（图4）。E组、F组SIEA皮瓣组织样品均未见EGFP mRNA 表达。

2.4 组织病理学检查：术后第7天，光镜下实验组A、B、C、D组SIEA皮瓣内血管外膜周围可见少量淋巴细胞浸润，但无明显血管炎表现及水肿表现，组织结构清晰。对照组E、F组可见少量中性粒细胞浸润，类似轻度非特异性炎症反应。

3讨论

近年来，针对复合组织瓣进行的基因治疗研究十分活跃，主要分为两种治疗方式，即间接体内法(Ex vivo)和体内法(In vivo)[2]。间接体内法是从患者身上获取细胞，在体外进行细胞培养，将目的治疗基因通过载体系统转染到培养的细胞内，经过转基因的筛选和扩增后将获得目的治疗基因的细胞送回患者体内，这是基因治疗前期最常用的方法。体内法是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体中，然后利用载体系统直接导体内。目前对体内法研究日益增多，成为基因治疗最有前途的方法。体内基因治疗复合组织瓣的给药途径主要有三种：局部注射、经静脉注射系统给药、经动脉灌注给药。由于经静脉注射系统给药后能够到达局部的较少；局部注射相对应用较为广泛，但局部注射造成的机械压力损伤和基因表达不均匀等缺陷限制了它们在基因治疗中取得最佳的疗效[3]。1998 年Taub PJ 首次报道应用VEGFcDNA经动脉灌注腹部缺血皮瓣，提高缺血皮瓣的存活面积[4-5]，是复合组织瓣经动脉灌注基因治疗的雏形。复合组织瓣经动脉灌注其微血管床后，可以作为目的基因表达载体并最终产生目的蛋白。与局部注射和全身转染的方法相比，经动脉灌注复合组织瓣的方法局部靶向性更强并且更加有效。

大鼠SIEA皮瓣是整形外科常用的皮瓣研究对象，其组织结构中包含表皮、真皮全层皮肤以及薄层肉膜结构，可以作为复合组织瓣进行研究[6]。1984年Petry JJ和Wortham KA详细报道了大鼠SIEA皮瓣的解剖，其直接血供为腹壁浅动静脉，间接血供为股动静脉[7]，血管位置恒定、有稳定的组织灌注区域，大鼠股动、静脉内径约0.5mm左右，易于置管灌注操作。本实验采用大鼠带蒂SIEA皮瓣，简化了灌注操作流程，并提高术后皮瓣成活率。我们在实验中采用活体成像系统直接观察术后皮瓣EGFP表达情况，使目的蛋白的检测更佳直观。共聚焦显微镜观察结果表明，腺病毒载体可以将外源基因EGFP转染至SIEA皮瓣的血管内膜、外膜以及血管外实质组织（脂肪、毛囊、肉膜），并且表达基因产物。为进一步深入研究经动脉灌注转染复合组织瓣，建立了一套简便、可靠的动物研究模型。

应用复合组织瓣转移修复创面是一种成熟的手术方式，以往在整形外科领域仅承担创面修复重建的功能。本实验经动脉灌注复合组织瓣的微血管床，使复合组织瓣产生目的蛋白，发挥兼具修复重建与治疗的双重功能。这项技术不仅可以应用于皮瓣自身的治疗，还可以对肿瘤切除后创面及慢性难愈性创面的进行治疗性修复[8]。未来，我们将为选择高效、安全的载体及合适的目的基因做进一步深入研究。

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[4]Taub PJ, Marmur JD, Zhang WX . Effect of time on the viability of ischemic skin flaps treated with vascular endothelial growth factor (VEGF) cDNA[J]. J Reconstr Microsurg,1998,14:387-390.

[5]Taub PJ, Marmur JD, Zhang WX. Locally administered vascular endothelial growth factor cDNA increases survival of ischemic experimental skin flaps[J]. Plast Reconstr Surg,1998,102:2033-2039.

[6]潘华,郭树忠,张旭东,等. 近交系大鼠腹部游离皮瓣移植模型的建立及意义[J]. 中国美容医学, 2007, 16(12): 1672-1675

[7]Petry JJ, Wortham KA. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat[J]. Plast Reconstr Surg,1984,74: 410.

[8]Marlese P, Cynthia H, Michaels J, et al. Using genetically modified microvascular free flaps to deliver local cancer immunotherapy with minimal systemic toxicity[J]. Plast Reconstr Surg, 2008,121: 1541-1553.

[收稿日期]2008-11-20[修回日期]2009-1-10