山羊SKIP基因重组腺病毒载体的构建

摘要：试验利用Gateway技术构建含山羊SKIP基因的重组腺病毒载体。首先采用PCR扩增山羊SKIP基因连接入pcDNA3.1（+），将酶切回收的SKIP产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-2 获得重组质粒pYr-adshuttle-2-SKIP。从该重组质粒上，利用LR同源重组将SKIP-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAd/PL-DEST，获得重组腺病毒质粒pAd-SKIP。该质粒经pacI 线性化后转染HEK293A细胞包装病毒，获得重组腺病毒rAd-SKIP。重组腺病毒分别经酶切和PCR 等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有SKIP基因的目的片段，荧光显微镜发现该重组腺病毒能在C2C12细胞中高效表达。表明成功构建了同时表达SKIP蛋白和绿色荧光蛋白的重组腺病毒，为下一步开展关于SKIP基因的功能研究奠定了基础。

关键词：重组腺病毒；山羊SKIP基因；基因过表达；感染细胞

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5258-04

Construction of A Recombinant Adenovirus Vector pAd-SKIP

XIONG Qi，ZHANG Nian，SUO Xiao-jun，LI Xiao-feng，LIU Yang，CHEN Ming-xin

（Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding / Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： In this study， the Gateway technology was used to construct a recombinant adenovirus vector pAd-SKIP. The SKIP gene was amplified first by PCR and inserted into pcDNA3.1（+） vector， then cloned into adenovirus adshuttle vector pYr-adshuttle-2 to obtain recombinant plasmid pYradshuttle-2-SKIP. The expression cassette of SKIP-EGPF was transferred to pAd/PL-DEST with LR recombinant reaction to acquire recombinant adenovirus plasmid pAd-SKIP-EGFP. The correct clone was linearized and tranformed into 293A cells. Recombinant adenovirus pAd-SKIP was obtained and identified. The transfection efficiency was observed under the fluorescent microscope. The results confirmed that the recombinant adenovirus vector contained goat SKIP gene. This vector was found to infect C2C12 cells efficiently. It indicated that the recombinant adenovirus expressing SKIP gene and green fluorescence was successfully constructed， laying the foundation for further study.

Key words： recombinant adenovirus vector； goat SKIP gene； gene overexpression； infected cells

5′肌醇磷酸酶（SKIP）由Ijuin等[1]首先发现并分离，在动物各组织中广泛表达，尤其在心脏骨骼肌和肾脏中高表达，因此SKIP被称为骨骼肌和肾脏富含的5′肌醇磷酸酶。SKIP被鉴定为通过水解PI（3，4，5）P3为PI（3，4）P2而调控胰岛素信号的5′-脂质磷酸酶。PI（3，4，5）P3的下游PI（3，4，5）P3/Akt信号在成肌分化进程中有重要作用[2-4]。SKIP杂合突变小鼠比目鱼肌和股四头肌的质量显著提高[5]也提示SKIP具有调节骨骼肌纤维发育的功能。因此有必要进一步研究该基因在体内外参与骨骼肌生长发育的调控机制。本试验采用基因工程技术，成功构建了SKIP基因重组腺病毒，为下一步在体内外研究SKIP对成肌分化的作用机制以及SKIP基因的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

真核表达载体pcDNA3.1（+）和腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-2购自长沙赢润生物技术有限公司；腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST、LR重组酶、DMEM培养液及新生牛血清购自Invitrogen公司。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；CloneEZ试剂盒购自Genescript公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、dNTPs、Taq酶及DNA Maker购自天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉和胰蛋白胨购自Oxide公司；腺病毒包装细胞HEK293购自美国ATCC；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计、合成及PCR扩增 应用Primer5.0软件设计引物，在上、下游引物5′端分别引入用于定向克隆的限制性酶切位点KpnⅠ、XhoⅠ，同时在上游引物中添加kozak序列GCCACC，用以增强基因表达。提取山羊体细胞RNA反转录成cDNA为模板扩增目的基因，引物序列如下：SKIP-F：5'GGTACCGCCACCATGGAGGCCATGAG3′；SKIP

-R：5'CTCGAGTCAGATCTGTGGCTGGGCTTCAT3′。反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s， 75 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否出现预期中的SKIP基因带。

1.2.2 pcDNA3.1（+）-SKIP质粒的构建 将pcDNA3.1（+）和两端带酶切位点的SKIP基因分别以KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，分别回收的线性化pcDNA3.1（+）质粒和SKIP cDN段以定向克隆的方式用T4 DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，挑选菌落扩增，小量提取质粒后以KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，若电泳后得到1.3 kb和5.4 kb两个片段，则证明SKIP cDNA已插入到真核表达载体pcDNA3.1（+）上。

1.2.3 SKIP基因克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-2 用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切穿梭载体pYr-adshuttle-2和重组表达载体pcDNA3.1（+）-SKIP，凝胶电泳回收线性化的pYr-adshuttle-2和SKIP基因，用T4 DNA连接酶连接过夜，反应产物转化大肠杆菌DH5α。次日挑取卡那霉素选择性培养基筛选的阳性克隆子进行菌落PCR鉴定；提取质粒进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定；同时送阳性菌落到北京奥科生物公司测序。

1.2.4 采用LR体外同源重组将SKIP表达框克隆至腺病毒表达载体pAd/PL-DEST 在10 μL LR体外同源重组反应体系（含pYr-adshuttle-2-SKIP、pAd/PL-DEST和LR Clonase Ⅱ）中，加入蛋白酶K消化LR Clonase Ⅱ。将充分反应后得到的反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含AmpR抗性（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上，37 ℃恒温箱培养过夜。接着再次从每个培养皿上随机挑取若干个单克隆菌落接种于50 mL含AmpR抗性（终浓度为100 μg/mL）的LB培养液中，37 ℃恒温摇床（250 r/min）培养过夜。用中量提取试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行PCR验证XbaⅠ酶切鉴定。

1.2.5 重组腺病毒pAd-SKIP的包装 HEK293A细胞的准备：提前12～24 h将1 mL HEK293A细胞悬液（1.5×106 个细胞/mL）接种在培养皿中，转染前1 h换成无血清的DMEM培养基250 μL。

转染HEK293 A细胞包装病毒：用脂质体2000介导，由PacⅠ线性化的腺病毒DNA转染HEK293 A细胞。当有明显的细胞病态反应（CPE）现象，且有>50%脱壁时即收细胞，加入500 μL无菌PBS缓冲液重悬，干冰浴和37 ℃间快速反复冻融3次裂解细胞，室温下1 000 r/min离心15 min，沉淀细胞碎屑。将上清液再次感染HEK 293 A细胞扩增病毒，直至细胞在1周内有明显的CPE现象，且有>50%脱壁时即收细胞。同样用无菌PBS缓冲液重悬，干冰浴和37℃间快速反复冻融3次裂解细胞，室温下1 000 r/min 离心15 min，收集上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-80 ℃保存。并进行PCR鉴定。

1.2.6 测定重组腺病毒滴度 取纯化后的病毒液100 μL，10%SDS 20 μL、PBS 880 μL，65 ℃热浴30 min后，涡旋3次，离心后测定病毒基因组DNA的OD260 nm和OD280 nm，据此计算病毒的颗粒数和纯度，1 OD260 nm =1012 PFU/mL，若OD260 nm /OD280nm >1.3，表明纯度较高。病毒滴度（PFU/mL）=OD260 nm×稀释度×1012。

1.2.7 病毒感染C2C12细胞 将C2C12细胞（1×106个细胞/mL）接种于12孔板，每孔1 mL，12 h后将培养液吸出，各孔分别加入MOI 50～150的Ad-SKIP，常规培养48 h后，在倒置荧光显微镜下分别用可见光和荧光观察、成像。

2 结果与分析

2.1 pcDNA3.1（+）-SKIP的酶切鉴定结果

用KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，PCR扩增SKIP基因的正反向引物分别带有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。将含有插入方向正确的SKIP cDNA的重组pcDNA3.1（+）-SKIP经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切产生大小分别为1.3 kb和5.4 kb的片段（图1）。

2.2 pYr-adshuttle-2-SKIP的重组鉴定结果

将SKIP基因连接入pYr-adshuttle-2载体，阳性克隆经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，pYr-adshuttle-2载体大小为4 470 bp，SKIP基因大小约为1 350 bp，由酶切结果（图2）可知，该克隆为正确克隆。将酶切鉴定正确的pYr-adshuttle-2-SKIP送去测序。并将测序结果与欲得到的目的序列相比对，显示获得的SKIP基因片段序列完全正确，证实pYr-adshuttle-2-SKIP构建成功。

2.3 重组腺病毒载体pAd-SKIP的鉴定

将SKIP基因表达框采用LR体外重组技术克隆至表达载体pAd/PL-DEST，阳性克隆经XbaⅠ单酶切鉴定，可切出一条约550 bp和一条约2.3 kb的条带，且大带大于8 kb（实际有3条大带，即18 kb、8 kb、8 kb，但是一般很难分开，所以看上去就是一条粗带）。由图3结果可以初步判断pAd-SKIP构建成功。接着以质粒pAd-SKIP为模板，设计引物扩增SKIP片段，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。由图4可见，PCR扩增出的片段大小与SKIP基因片段大小一致，证实pAd-SKIP载体构建成功。

2.4 重组腺病毒rAd-SKIP的产生和PCR鉴定

将PacⅠ线性化的腺病毒DNA转染HEK293A，当细胞有明显的CPE现象，且有>50%脱壁时即收细胞进行裂解收病毒。提取腺病毒基因组DNA，以之为模板进行PCR反应。引物用载体上自带的CMV和BGH引物验证。由PCR鉴定结果（图4）可知，用载体上自带的引物扩增出与SKIP基因长度同样大小的片段，表明此腺病毒中有SKIP基因，而且相关表达框都在。证实rAd-SKIP包装成功。

2.5 重组腺病毒对成肌细胞C2C12的感染

用不同MOI的重组腺病毒感染C2C12细胞，当MOI为150时，超过80%的细胞出现荧光（图5），表明所构建的重组腺病毒生物活性高，可以有效地转导目的基因表达。

3 小结与讨论

SKIP是调节PI3K-Akt信号通路的关键5′肌醇磷酸酶。在肌源细胞中，血清饥饿可诱导IGF2自分泌。IGF2与IGF1受体互作，激活PI3K，产生PI-3，4，5-P3，PI-3，4，5-P3募集到细胞膜上激活Akt（蛋白激酶B），接着激活成肌基因的转录[5]。因此PI3K-Akt信号与成肌分化紧密相关。近年来，一些新的信号通路、分泌因子和信号分子不断被发现能调控PI3K-Akt信号。如肌醇磷酸酶SKIP，它通过水解PI3K合成的脂质第二信使PI-3，4，5-P3，参与Akt（蛋白激酶B）的激活[6-8]。但SKIP是否调控PI3K-Akt信号介导的成肌分化仍有待研究。

基因的过表达是研究基因功能的重要手段之一，将外源基因有效地导入靶细胞表达是后续研究的先决条件。腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中瞬时及高水平地表达目的蛋白。具备宿主范围广，不依赖细胞周期，病毒滴度高，有较好的生物安全性等优点[9]。腺病毒表达系统中的难点主要在于如何将外源基因表达框或者外源的shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。由于腺病毒骨架载体比较大（～30 kb），而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，如果用常规的酶切-连接的方式将外源基因或者shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上，则成功率很低，因此，目前的腺病毒表达系统基本上都是用同源重组的方法将外源基因构建至腺病毒骨架载体上。

本试验采用了Invitrogen公司的BLOCK-iT腺病毒表达系统和Gateway 技术，与市面上其他腺病毒表达系统往往利用大肠杆菌或者293细胞自身的同源重组系统不同，即利用LR 重组酶进行体外重组。与当前其他腺病毒表达系统相比，这种体外重组更加方便、快速，重组效率更高。在本研究中，构建了含山羊SKIP基因的腺病毒载体，并且经酶切鉴定分析和PCR结果证实SKIP重组病毒构建成功。病毒滴度高，并且可以高效感染C2C12细胞，表达能有效介导基因转染，为下一步证实SKIP对骨骼肌细胞成肌分化的调控等研究奠定了基础。

参考文献：

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