高原严重烧伤延迟复苏大鼠脑损伤与兴奋性氨基酸水平变化

【摘要】 目的：观察高原严重烧伤延迟复苏后早期大鼠脑损伤及兴奋性氨基酸含量的变化. 方法：130只雄性Wistar大鼠随机分为烧伤即时复苏组(n=60)、烧伤延迟复苏组(n=50)和正常对照组(高原地区正常对照组n=10和兰州地区正常对照组n=10). 前两组动物被制成高原（海拔3800 m）烧伤实验动物模型（TBSA 30％，Ⅲ度）. 运用高效毛细管电泳法检测脑组织中兴奋性氨基酸（谷氨酸，Glu）含量，采用干、湿重比重法测定脑组织含水量，原位末端标记（TUNEL）观察脑皮质神经细胞凋亡. 结果：从兰州地区急进高原后，大鼠脑组织Glu含量、脑组织含水量、脑皮质中TUNEL阳性细胞数均未发生明显改变（P>0.05）；高原严重烧伤后脑组织Glu水平于伤后1 h即显著降低，持续至伤后24 h，于伤后72 h恢复至正常水平（P<0.05）；延迟复苏组脑组织Glu水平在观察时限内均低于上述两正常对照组，延迟复苏组与即时复苏组相比除在伤后12 h时相点无统计学差异外，其余时相点均低于即时复苏组（P<0.05）. 而脑组织含水量于伤后6 h开始升高，于24 h达高峰，于伤后7 d降至正常水平；高原烧伤延复组变化趋势同高原烧伤即复组，但伤后7 d仍未恢复. 脑皮质TUNEL阳性细胞在伤后1 h即增多，也于伤后24 h达高峰，伤后7 d仍高于正常水平. 结论：由兰州地区急进到高原地区，并不足以导致大鼠脑组织中兴奋性氨基酸含量发生变化及大鼠脑水肿的发生和脑皮质凋亡细胞数的增加；高原严重烧伤及延迟复苏后，细胞外兴奋性氨基酸减少，同时伴有受伤大鼠迅速出现脑水肿，脑皮质凋亡细胞显著增加.

【关键词】 烧伤；延迟复苏；兴奋性氨基酸类；脑水肿；细胞凋亡；大鼠

0引言

严重烧伤引起的脑损伤及脑水肿在平时和战时均很常见，已有大量文献报道［1-3］. 大量研究显示兴奋性氨基酸（excitatory amino acids, EAAs）的大量释放而产生的毒性作用，在加重继发性脑损伤中起重要作用.本研究利用大鼠严重烧伤后即时复苏与延迟复苏模型，初步观察高原严重烧伤延迟复苏后早期大鼠脑组织中兴奋性氨基酸含量变化及与脑损伤的关系.

1材料和方法

1.1材料

健康雄性Wistar大鼠130只，体质量（250±30）g（兰州总医院实验动物科）；细胞凋亡原位检测试剂盒（AP）,去核酸酶的蛋白酶K（德国Roche）；TritonX?100,牛血清白蛋白、2，4?二硝基氟苯（美国Sigma）；Brij35（美国Amresco）；L?谷氨酸（北京拜尔迪生物技术有限公司）；多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其余试剂均为国产分析纯；高效毛细管电泳仪（LP/ACE5000）（美国Beckman Coulter Co.）.

1.2方法

1.2.1动物模型及分组

致伤前1 wk，置室温19~25℃. 实验前24 h用电推推去背部被毛，单笼饲养. 实验前12 h禁食、水. 用含10 g/L的戊巴比妥钠ip注射麻醉（40 mg/kg）后，除正常对照组外，于大鼠背部建立30%Ⅲ度烫伤模型（病理证实）. 致伤条件为90℃，20 s. 正常对照组：模拟烫伤（37℃水浴，20 s）. 动物随机分为4组：高原烧伤即时复苏组（高伤即复，n=60），伤后立即腹腔注射等渗盐水（按Parkland公式） 4 mL/kg；设立观察与检测时间点：1 h（PB1h），6 h（PB6h），12 h（PB12h），24 h（PB24h），72 h（PB72h），7 d（PB7d）；高原烧伤延迟复苏组（高伤延复，n=50），伤后6 h开始补液；设立观察与检测时间点：PB6h，PB12h，PB24h，PB72h，PB7d；高原正常对照组（高正常，n=10），不补液. 兰州地区正常对照组（兰正常，n=10，海拔1517 m），不补液.

1.2.2取材和实验

高伤即复组大鼠于伤后1，6，12，24，72 h，7 d 6个时相点，高伤延复组大鼠于伤后6，12，24，72 h，7 d 5个时相点分别取材，每个时相点各取10只动物，固定于实验台，于各时相点抽血后，将大鼠断头，迅速取脑，置0℃冰盐水冲洗，去除血液、大血管等结缔组织，吸干；用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗后，用双面刀片于脑正中线将脑组织纵形剖开，将大脑左半球切取完整的薄片（约 0.5 cm）后置于40 g/L的中性甲醛混合固定液，放于4℃冰箱，用于光镜检查及免疫组织化学检测. 将上述剩余脑组织大脑皮质，用电子天平称重后置于80℃烤箱36 h再称重，利用组织干湿重比值，观察脑组织含水量，以检测脑水肿的变化. 将大脑右半球迅速放置于冻存管中置于液氮中保存，用于兴奋性氨基酸的检测.

谷氨酸含量采用高效毛细管电泳法［4］检测脑组织中谷氨酸含量. 所得结果用μmol/g表示. 脑组织含水量采用干湿比重法测定［5］：脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%. 细胞凋亡实验步骤按文献［6］及说明书并稍作改进进行. DAB显色，显微镜下观察，细胞核中出现棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞.

统计学处理：所得数据以x±s表示，采用SPSS统计软件对组间差异进行单因素方差分析及两两比较，P<0.05为有统计学意义.

2结果

2.1谷氨酸浓度变化急进高原（高正常）后脑组织Glu水平较兰正常组稍降低，但统计学无差异（P>0.05）；高原严重烧伤后，高伤即复组Glu水平于伤后1 h即显著低于上述两正常对照组，于伤后6 h开始回升，于12 h再次下降，伤后24 h又升高，伤后72 h恢复至正常水平（P<0.05）；高伤延复组脑组织Glu水平在观察时限内均低于上述两正常对照组，高伤延复组与高伤即复组相比除在伤后12 h时相点无统计学差异外，其余时相点均低于高伤即复组（P<0.05, 图1）.

2.2脑组织含水量变化兰正常组脑组织含水量为60.28％. 与兰正常相比，高正常组脑组织含水量略升高但无统计学意义（P>0.05）. 高原严重烧伤后，高伤即复组于伤后6 h脑组织含水量开始升高，伤后24 h达高峰，随后下降，伤后7 d降至正常水平；高伤延复组变化趋势同高伤即复组，也于伤后24 h达高峰，但伤后7 d仍高于上述两正常对照组，且两组间对应时相点相差无统计学意义（P>0.05, 图2）.

2.3细胞凋亡兰正常组脑皮质中只检测到很少的TUNEL阳性细胞（2个/高倍视野），高正常组脑皮质中TUNEL阳性细胞数较兰正常组稍增高（3.67个/高倍视野），但两者无统计学差异；而高伤即复组脑皮质在各时相点均检测到的TUNEL阳性细胞较上述两正常对照组明显增多（P<0.01），随着受伤时间的延长，标本TUNEL阳性细胞逐渐增多，于伤后24 h达高峰（233.67个/高倍视野），此后TUNEL阳性细胞数则呈现下降趋势，伤后7 d仍显著高于上述两正常对照组. 高伤延复组脑皮质中TUNEL阳性细胞数变化趋势基本与高伤即复组相同，于伤后6 h显著升高，但于12 h有一个下降过程，随后开始增加，也于24 h达峰值(216个/高倍视野,图3)；但高伤即复组及高伤延复组在上述各时相点所检测到的凋亡细胞数无统计学差异（P>0.05). TUNEL标记阳性的细胞核被染成棕褐色，胞浆复染为淡蓝色.

3讨论

海拔3000 m，大多数人在静息状态下可出现不同程度的高原反应，随着海拔高度的增高，高原病的发病率逐渐增加［7］. 脑组织对氧的需求量高，对缺氧的耐受性差，是机体对缺氧最敏感的组织［8］. 脑缺血再灌注损伤的机制十分复杂，能量代谢、细胞内钙、细胞凋亡、兴奋性氨基酸毒性、细胞因子、氧自由基（ROS）产生和炎症反应等可能与再灌注损伤有关［9］. 本研究在高原海拔3800 m实地环境条件下研究高原大鼠严重烧伤延迟复苏后脑组织兴奋性氨基酸含量动态改变及与脑损伤的关系.

黎海涛等［10］报道犬严重烧伤早期即有脑水肿形成，伤后12 h已十分明确. 本研究结果显示，由兰州地区（1517 m）饲养的大鼠通过急进高原地区（3800 m），我们发现两组脑组织含水量并无统计学差异（P>0.05），表明本组动物急进高原后并未直接导致脑水肿的发生；但当大鼠严重烧伤后，即高伤即复组脑组织含水量于伤后24 h达峰值，伤后72 h脑水含量开始下降，伤后7d恢复正常；高伤延复脑组织含水量变化趋势基本与高伤即复组相似，但于伤后7 d，仍未恢复正常.

中枢神经系统中作为神经递质的游离氨基酸分2类，即抑制性递质（如甘氨酸，γ?氨基丁酸）和兴奋性递质，它们共同维持着正常的神经生理活动. 近期研究显示， Glu等兴奋性氨基酸在缺血性神经细胞损伤中起关键作用. 其主要作用表现在两个方面：即缺氧缺血时细胞间隙EAA的堆积和EAA受体的过度激活［11］. 缺血时间愈长，脑间质Glu与Asp的峰值浓度愈高，神经病理学和神经学损伤愈严重，这与EAAs毒性作用为浓度依赖性呈一致性［12］. 但本实验研究却发现，大鼠急进高原后，虽然存在急进高原后的低氧、低气压等环境影响因素，但高正常组脑组织中Glu水平较兰正常组并未出现较大的变化，而且在严重烧伤后，大鼠脑组织中Glu含量较正常对照组（兰正常,高正常）不升反降，特别是高伤延复组在所观察时相点均低于正常对照组，与文献报道一致［13］. 考虑其主要机制可能是神经细胞与胶质细胞的EAAs再摄取功能在再灌注后迅速恢复，提示EAAs在延迟性神经细胞损伤的过程中的可能作用. 本组研究结果也显示高原烧伤及延迟复苏缺氧缺血后EAA的动态变化可能有着与平原烧伤不同的特点，其不同点有待于今后进一步研究.

【参考文献】

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