重组人细胞外基质磷酸化糖蛋白对人牙髓细胞体外矿化的影响

[摘要]目的：探讨细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE）对人牙髓细胞（human dental pulp cells，HDPCs）在体外的矿化能力的影响，从而了解该蛋白在牙齿生长发育过程中的作用。方法：常规方法培养获得人牙髓细胞，实验组中使用的MEPEs的浓度为100μg/L。通过Von kossa染色观察MEPE对人牙髓细胞矿化的影响。结果：MEPE蛋白能促进人牙髓细胞的矿化。结论：MEPE具有促进人牙髓细胞的矿化的能力，可能在牙齿生长发育过程中起着重要的作用。

[关键词]牙髓细胞；矿化；细胞外基质磷酸化糖蛋白

[中图分类号]Q813.1 Q591.2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）05-0542-03

这些年来， 牙髓生物学已变为口腔内科学研究领域的重点和热点。在牙髓生物学的研究过程中人牙髓细胞是其中最重要细胞来源，这是因为人牙髓细胞容易获取，并且容易在体外培养扩增，同时具有成骨能力确切以及多向分化潜能的优点。骨组织和成牙本质细胞中可以表达细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix extracellular phosphoglycopro tein，MEPE）。成牙本质细胞分泌的MEPE，可以运至细胞外基质中，可能在牙髓细胞的分化以及牙髓牙周组织的矿化过程中发挥重要作用。目前关于MEPE蛋白的确切功能还没有明确结论，而MEPE蛋白的生物学功能可以通过组织表达的特点进行研究。本实验拟通过细胞培养技术，组织化学，体外矿化实验等方法，研究MEPE在牙髓生理反应中的作用机制，同时观察MEPE对体外培养的人牙髓细胞矿化能力的影响， 为临床应用MEPE提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器：重组人MEPE蛋白；兔SP Kit（上海生工公司，中国）；噻唑盐（GIBCO，美国）；DMEM培养液（AMERSCO，美国）；牛血清白蛋白（BSA）（北京中山生物技术有限公司，中国）；胎牛血清（FBS）（GIBCO，加拿大）；倒置、相差显微镜（Nikon，日本）；CO2细胞培养箱（北京中山生物技术有限公司，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 人牙髓细胞的体外培养：选择12～18岁因正畸需要拔除的恒牙。拔除后在无菌条件下分离牙髓组织，放置于含链霉素、青霉素、两性霉素 B （浓度均为10mg/L）的 PBS 溶液里。在PBS溶液中浸泡3次，每次5min。然后把牙髓组织剪切成1mm大小的碎块，把组织块平铺在含有Ⅰ型胶原的25cm DMEM培养瓶里，其中每瓶约含30块牙髓组织块。把含有牙髓组织块的DMEM培养瓶在CO2细胞培养箱（37℃，5% CO2）中培养。当观察到原代培养组织细胞块周围长出细胞后，使用倒置显微镜观察组织贴壁的情况。培养过程中每周换液至少1次，当细胞长满2/3瓶时，使用0.01 %EDTA 和0.25 %胰酶的混合溶液，以1∶1进行消化，并且按 1∶2 进行传代培养。传到第6代作细胞学检测。

1.2.2 MEPE的配制及分组：用PBS缓冲液将MEPE冻干粉配成1g/L的溶液，再将浓度稀释为100μg/L进行实验。

1.2.3 Von kossa染色：实验分组放置于96孔培养板内，将传代培养人牙髓细胞以1×106/cm2浓度接种于培养板内，每孔加入0.5ml。DMEM培养液中含φ=10%FCS、50μg/ml L-抗坏血酸10μmol/L β-磷酸甘油。φ（CO2）=5%、饱和湿度37℃环境下培养。每3天更换培养液，培养至第28天，吸除培养液，PBS漂洗3遍。加入40g/L多聚甲醛，4℃低温下固定24h。采用Von kossa法进行钙盐沉积染色。吸除固定液，PBS振洗3次，每次5min。将培养板浸没于50g/L硝酸银溶液中，室温下浸泡2h。取出后蒸馏水反复冲洗3遍。浸入30g/L硫代硫酸钠溶液中浸泡5min，取出后充分水洗，蒸馏水漂洗3遍。滴入10g/L中性红衬染1min。酒精脱水，二甲苯透明，封固，镜检。

2 结果

2.1 人牙髓细胞的生长：使用倒置相差显微镜观察，在接种两天后，牙髓细胞开始贴壁， 这时出现大量增殖， 第6天可见大量克隆细胞，细胞表面及四周有大量红细胞。换去全部液体，洗去大部分红细胞，镜下贴壁细胞成不规则三角形或纺锤形，成纤维细胞集落样方式生长， 并且可以观察到长短不同的突起（图1），证明人牙髓细胞培养成功。

2.2 Von kossa染色结果见图2。

3 讨论

牙本质是重要的牙体组织，它具有一些重要的生理功能，是构成牙齿的主体，也承担着感觉、修复等重要作用。生物矿化是目前口腔医学研究的的重点和热点，这项研究可以阐明牙齿的形成，了解牙体牙髓损伤修复的机制以及指导龋病的临床治疗。目前普遍认为细胞外基质蛋白在此过程中起到重要的作用。

MEPE，又称成骨细胞或骨细胞因子45（Osteoblast/Osteocyte Factor 45；OF45）被归为 SIBLING （Small Integrin-Binding LIgand，N-linked Glycoprotein）家族。MEPE与骨桥素（osteopontin，OPN），釉蛋白（enamelin，ENAM）等在基因水平和蛋白质水平的结构以及功能等多方面具有相当多的相似之处。 2000年，Rowe等[1]发现了MEPE，该研究组进行RT-PCR肿瘤性低血磷性骨软化症（oncogenic hypophosphatemic osteomalacia，OHO）患者肿瘤组织的cDNA文库，发现文库的基因检测表达上调，该研究组发现MEPE可以在骨髓和大脑中表达，然而在肾、肺以及胎盘等组织中的表达水平比较低。Petersen等[2]在成骨细胞中克隆到MEPE基因，该研究组进行了组织免疫化学以及Northern blot等研究，其结果显示：MEPE在皮质骨和骨小梁中的骨细胞出现高表达，而且只表达在骨组织中。Heinrich等[3]发现MEPE不仅在骨细胞表达而且也可以在成骨细胞中表达。

MEPE在口腔医学研究方面的论著很少。有学者[4]认为MEPE可以在成牙本质细胞中表达，是牙本质发育异常性疾病的重要候选基因，该研究组发现MEPE与II型牙本质发育不良以及II牙本质发育不全等疾病的病因相关。有学者将MEPE植于大鼠牙髓腔中，一个月天后镜下可见形成大量修复性牙本质，结果显示MEPE可能可以促进牙髓细胞分化成为成牙本质细胞[5]。

在组织生长发育过程中，细胞外基质蛋白作为一种必需的信号分子，是细胞分化和附着的底物，其提供细胞生长的信号，控制细胞的附着并且为组织和细胞提供机械支持作用，细胞的生长和功能也受细胞外基质的影响。因此，细胞外基质是细胞进行增殖、迁移和分化的前提[6-9]。本实验通过Von kossa染色观察MEPE对人牙髓细胞矿化的影响，发现MEPE蛋白可以促进人牙髓细胞的矿化，也就意味着MEPE蛋白在牙齿生长发育过程中起着重要的作用。本实验初步探讨了MEPE蛋白对人牙髓细胞矿化能力的影响，但是关于MEPE的分子机理研究还需不断深入。

[参考文献]

[1]Rowe PS， de Zoysa PA， Dong R，et al.MEPE， a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J]. Genomics，2000， 67（1）：54.

[2]Petersen DN，Tkalcevic GT，Mansolf AL，et al. Identification of osteoblast/osteocyte factor 45 （OF45）， a bone-specific cDNA encoding an RGD-containing protein that is highly expressed in osteoblasts and osteocytes[J]. J Biol Chem，2000，275（46）： 36172.

[3]Heinrich J，Pavlin D，Yang W，et al. MEPE expression in osteocytes during orthodontic tooth movement[J]. Achives of oral biology，2011，52（6）： 684-690.

[4]Mac Dougall M， Simmons D，Gu TT， et al. MEPE/OF45， a new dentin/bone matrix protein and candidate gene for dentin diseases mapping to chromosome 4q21[J].Connect Tissue Res，2009，43（2-3）：320.

[5]Hanguo Wang， Nobuyuki Kawashima， Takanori Iwata， Jing Xu， Satomi TakahashiToshihiro Sugiyama， Hideaki Suda. Differentiation of odontoblasts is negatively regulated by MEPE via its C-terminal fragment[J].Biochem Biophys Res Communicat，2010，398（5）：406-412.

[6]Robey PG. Bone matrix proteoglycans and glycoprotein. Principles of Bone Biology[M].San Diego： Academic Press，1996：155.

[7]Nagel DE，Khosla S，Sanyal A，et al. A fragment of the hypophosphatemic factor， MEPE， requires inducible cyclooxygenase-2 to exert potent anabolic effects on normal human marrow osteoblast precursors[J]. J Cell Biochem， 2012， 93（6）： 1107-1114.

[8]Argiro L，Desbarats M，Glorieux FH，et al.Mepe，the gene encoding a tumor-secreted protein in oncogenic hypophosphatemic osteomalacia，is expressed in bone[J].Genomics，2011，74（3）：342.

[9]Qin C，Baba O，Butler WT. Post-translational modifications of sibling proteins and their roles in osteogenesis and dentinogenesis[J].Crit Rev Oral Biol Med，2009，15（3）：126.

[收稿日期]2013-01-22 [修回日期]2013-03-21