RU486诱导调控系统

随着基因治疗研究的不断深入,目的基因的精确表达已经成为首要问题。由于解决上述问题最好的方法就是拥有一系列复杂严密的基因调控系统,所以研究者们一直在寻求一种高效可靠的诱导调控体系,而RU486 诱导调控系统就是目前找到的较好的一种。近十年来这一系统的研究已很广泛,它的结构也有几次大的改进,现就此予以综述。

一 RU486调控系统的结构

1 RU486调控系统的基本结构

RU486 调控系统是1994 年被Wang 等[1]提出的,它由嵌合调控子反式作用调控区和目的基因区两部分组成。反式作用调控区含有任意启动子控制下的嵌合调控子(chimeric regulator, GLVP),后者是一种嵌合型的可诱导转录因子,它包括酵母转录因子Gal4 的DNA 结合区(Gal4DBD)、单纯疱疹病毒蛋白VP16 激活区(VP16AD)和PR-891 突变体改良后的C 末端配体结合区(PRLBD-891)三部分。目的基因区是指在最小启动子(TATA盒或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子tk)和四个Gal4 DNA结合区串联体(p17×4)调控下的目的基因,如图1。

图1 RU486 调控系统的结构示意图

在GLVP中,Gal4DBD 代替了孕酮受体的DNA结合区,从而避免了任何激活内源性孕酮敏感性基因的可能,并且由于GAL4 DBD在哺乳动物细胞中不

存在,目前也没有发现任何哺乳动物的靶基因可以被Gal4激活,所以这一调控子只会调控目的基因的表达,而不会影响任何内源基因[1]。PR-891是指野生型孕酮受体在891位点平头切断造成的突变体,因此其不能与孕酮受体激活剂R5020 结合,但却可以与抗孕酮片RU486结合,从而在RU486存在时激活孕酮受体介导的基因。这可能是由于PR-891比野生型受体少42个氨基酸,而孕酮结合位点属于缺失的下游内,RU486结合区则位于上游位置[2]。这就避免了给予RU486 时,激活内源性孕酮受体诱导其它基因引起一系列的细胞反应。并且由于反式作用调控子是一种嵌合型的可诱导转录因子,所以它不再与孕酮反应元件(PREs)或糖皮质类固醇应答成分(GREs)结合[3],干预孕酮受体介导的转录,取而代之的是在RU486作用下,这一调控子仅仅与目的基因区的Gal4DBD结合,并激活目的基因转录表达[2]。由于PRLBD-891的转活能力较差,而VP16AD,即VP16 的 C末端为酸性,可以直接与转录起始复合物中的转录因子TFIIB、TATA结合蛋白(TBP)和TBP辅助因子TAFII40相互作用,具有很强的转活功能。

在目的基因区内,启动子有两种:胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子(tk)和腺病毒E1b 基因中仅仅包含TATA 盒的最小启动子。Tsai[2]等使用氯霉素乙酰转移酶(CAT)作报告基因对二者进行比较发现,p17x4-TATA-CAT 比p17x4-tk-CAT 转染时CAT 基础活力明显要低一些;而给予RU486 后,前者的CAT 效能可达大约50倍,后者仅有10~15倍。这可能是由于tk启动子中含有GC 和CAAT 盒等序列,从而使转录效能较大。所以TATA盒启动子结构应用于要求目的基因的基础表达很低时,而在基础活力稍高能够耐受,要求转录效能很大时应使用tk 启动子结构。对于p17x4,Gal4 DNA结合区的四个串联体则在这一系统中可以提供最大的转录效能。

2 RU486 调控系统的结构改进

为了使RU486 调控系统将来能够应用于人类的基因治疗,降低细胞毒性和免疫原性,Mark等[4]1999年使用NFκB家族成员――人的p65激活区(286~550)替代VP16激活区,构建出新的RU486反式作用调控区(GLP65),以减少VP16 激活区可能带来的免疫反应。他们发现使用TATA盒启动子启动目的基因时,在没有RU486的情况下,GLP65的基础活力明显低于GLVP;给予RU486后两个调控子均表现出配体剂量依赖性的目的基因表达,这时GLVP组目的基因的表达更多,不过由于GLP65的基础值很低,所以RU486给予时,目的基因的表达倍数会更高。tk做目的基因启动子时,上述两种RU486系统则不管是否给予配体,两者的作用相当。所以在使用GLP65 时,最好选用TATA 盒启动子作为目的基因的启动子。

另外,Mark 等[4]在反式调控区与目的基因区之间插入小鸡β-球蛋白5’端区域作为绝缘子(INS)将二者分隔,使目的基因在没有RU486的情况下不受调控系统的调节而产生表达。但是他们发现在活体大鼠模型,没有RU486 表达,有无绝缘子都不会有目的基因的表达;但是HELA 细胞水平上,不含绝缘子者的目的基因则会有较少的表达,而含绝缘子者没有。

二 RU486调控系统的激活

RU486 调控系统的激活过程与甾体类激素被其配体激活相似。反式作用调控子可以在不同的组织定向启动子作用下,在各自靶向的组织或细胞进行表达。当存在RU486 时, RU486 与PRLBD-891 相结合,促使反式作用调控子发生构象变化形成二聚体而激活,激活的反式作用调控子与目的基因上游的Gal4 DNA 结合区四聚体结合,从而启动目的基因的表达,如图2。反之,在没有RU486 的情况下,由于反式作用调控子的构象不会发生变化,所以RU486 调控系统不能被激活,即目的基因不能转录表达。这样,RU486 调控系统便可根据RU486 的量及给予时间,对目的基因的表达水平及其表达时程的长短进行控制[2]。

图2 RU486 调控系统激活示意图

三 RU486调控系统的特点

1. 调控子的激活依赖于RU486 的给予。在没有RU486 的情况下,调控子所表达的蛋白没有毒性,也不传递表型,调控子不能激活目的基因的表达。只有给予RU486激活调控子后,目的基因才会表达蛋白。

2. RU486调控系统在转录水平调控目的基因的表达,所以可以直接控制后者的表达。

3. RU486给予量很小,仅仅能够激活调控子,并不能抑制内源性孕酮受体或糖皮质激素受体的功能。众所周知,RU486作为孕酮和糖皮质激素的拮抗剂时,它的浓度范围须达微克分子级,所以在临床使用中RU486 作为流产药物的剂量应达600mg或10mg/kg。然而,在RU486 调控系统中的RU486只需很少的浓度就可使目的基因表达。Wang等曾做RU486的浓度对照实验发现,当RU486 浓度仅有0.1nmol/l 时即可诱导目的基因的表达,并且系统达到最大活力时的浓度也仅须1nmol/l,这一剂量要比产生内源拮抗作用的浓度低 1000倍[1]。

4. 调控过程是可逆的,且其使目的基因大量表达。RU486停药后目的基因表达停止,RU486的重复给予也会重复诱导目的基因的表达。

5. RU486调控系统非常适用于中枢神经系统的基因治疗。因为服用RU486后,其很容易通过血脑屏障,在临床中可以安全使用。

四 RU486调控系统的应用

1 RU486调控系统在单纯疱疹病毒载体(HSV)中的调控

Oligino[5]等将RU486系统引入无复制能力HSV载体中,lacZ为目的基因的目的基因区(p17x5-TATA-lacZ)插入HSV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶位点,反式作用调控区(VP-GL)置入同一载体的糖蛋白C 位点,构建成HSV 重组病毒 GVHLZ。在病毒转染Vero 细胞24h后,他们发现如果不给RU486,lacZ表达很低;若将细胞培养在含10-7mol/L的RU486基质中时,lacZ就会大量表达。并且, 10-7mol/L的RU486 即可使目的基因表达达最大。将GVHLZ 注入SD 大鼠海马后12 和36h,给予RU486 或生理盐水作对照,48h 后处死大鼠取出海马进行检测,Oligino 发现lacZ表达比对照组高达150 倍。

2 RU486调控系统在腺病毒载体(Ad)中的调控

Magnus等[6]首次将RU486系统引入重组腺病毒载体中,CAT 作为报告基因与p17x5-TATA 结合插入Ad 中形成AdG5Tr

ipCAT,反式作用调控区插入Ad 形成Ad5dl309,将两者共转染HeLa 细胞。他们在转染开始给予RU486 后16h 用 ELISA法检测CAT的表达,发现CAT的表达随RU486给予量增加而逐渐增大,当RU486 达4umol/l时CAT达最大。

2004年,钱程[7]等成功构建出RU486调控并携带IL12的第三代腺病毒,并将其进行了体外及体内的实验验证,发现RU486可以诱导和调控IL12的表达,这种诱导呈剂量依赖性变化,并且在调整RU486 的给药间隔和重复给药,IL12 的表达也会随其波动变化或维持在一定水平,RU486 调控系统的基因开关作用表现完全。最近,Schillinger[8]等也将RU486 诱导调控系统引入到高血压的基因治疗,将RU486 调控系统控制的心房利尿肽(ANP)插入到第三代腺病毒载体中,从而实现了对ANP表达的剂量和时程控制。并且第三代腺病毒的超大容量、低免疫源性和低细胞毒性等优点使得这一系统更加完美。

3 RU486 调控系统在果蝇中的调控

Gregg Roman[9]等利用RU486调控系统对转入果蝇的目的基因进行时间和空间的调控。他们将RU486调控系统插入到P{Switch}放大检测元件构成的质粒注入果蝇胚胎中,待果蝇4天大时给予RU486饮食。结果发现通过RU486基因开关可以对目的基因进行时序上的调控,在给予RU486饮食后1h即可得到非常高浓度的表达,3h后指示针可以检测到目的基因的活力。并且RU486的给予不会引起任何的不良反应,它不会增加果蝇的致死率,也不会影响果蝇的趋光性、趋地性和逃避反应等行为,仅有基因开关的诱导功能。Osterwalder[10]等则利用 RU486调控系统对组织特异性的基因表达进行调控,发现在果蝇胚后期,RU486 调控系统可以调控幼虫神经肌肉接头突触前后的转基因表达。

4 RU486 调控系统在转基因动物中的调控

2005 年Bo 等[11]又将RU486 诱导调控系统转入到转基因大鼠体内,通过控制RU486 的给予观察转基因大鼠心内转基因的表达。他们使用心脏特异性α 肌球蛋白重链(αMHC)启动子调控GLP65 系统,将含有反式作用调控区的载体注射入FVB/N受精卵的前核得到αMHC-GLP65转基因大鼠,然后同样方法得到含人生长激素目的基因区(17X4-tk-hGH)的转基因大鼠,两者杂交得到双重转基因大鼠(αMHC-GLP65/Hgh),然后每天给大鼠腹腔内注射RU486(500ug/kg)观察。结果发现不给予RU486,hGH的表达始终处于很低的基础值;而随着RU486 的不断给予转基因大鼠的hGH 呈剂量依赖性表达,但在停药后七天内转基因表达即可降至基础水平;对于单转基因αMHC-GLP65大鼠,给予RU486后未发现任何表型出现。并且他们还首次报道,这一调控系统的作用对于任何年龄的大鼠都可适用。

五 其他的基因开关

目前基因开关的种类已经有很多,如四环素调控系统、甾体激素、免疫抑制剂、β-D-异丙基硫代半乳糖苷、FK1012 细胞膜调控系统等等。虽然这些调控系统各自有各自的应用范围和优点,但是其中有些可能会激活其它的内源基因,如 FK1012 细胞膜调控系统,它是运用一种免疫抑制剂FK506 的二聚体FK1012,通过激活细胞酪氨酸激酶途径来调控基因表达,因此由于细胞膜受体激酶级联反应干预多种内源基因的表达,所以这一系统无法调控特异的目的基因[2]。有些效力较低,或者在动物和人转基因运用中毒性较大(β-D-异丙基硫代半乳糖苷)。四环素调控系统则由于四环素在骨与其他组织的清除率较慢而引起关注。