松江湿地沉积物细菌T―RFLP分析中PCR体系的建立与优化

松江湿地为松花江河漫滩地，地势平缓，依托松花江呈东西向带状分布，包括松花江滩涂湿地和支流河口湿地在内的广阔湿地资源，是全国面积最大的原生态城市湿地。湿地内植物区系组成多样，生物多样性丰富，是黑龙江省哈尔滨市重点保护、开发、建设的生态文明区，也是近年来较重视的生态研究区。微生物是湿地生态系统的重要组成部分，在湿地养分的生物地球化学循环中往往起着核心作用，湿地沉积物中的微生物以细菌为主，细菌能参与湿地污染物和有毒物质的降解过程，有助于保持湿地生态系统的平衡和提高湿地自净能力。松江湿地的内部环境和结构较复杂，沉积物中蕴含着丰富的微生物资源，其细菌组成结构能良好地反应湿地环境因子的变化，深层次理解松江湿地生态系统结构和功能，而建立优化PCR体系是利用T-RFLP技术分析微生物资源的前提条件。

末端限制性片段长度多态性（terminal restric-tion fragment length polymorphism， T-RFLP），又称为16S rRNA基因的末端限制性片段（terminal re-striction fragment，TRF）分析技术，是建立在PCR基础之上研究微生物多样性的一种新兴分子生物学研究方法，不依赖于培养即可对微生物进行群落结构分析，具有非常广阔的应用前景。T-RFLP技术具有快速、高度的可重复性、良好的可操作性和产生大量的可操作单元（OTUs），能够与数据库建立直接联系，用于微生物菌种鉴定、群落的对比和多样性分析。本研究对在松江湿地沉积物细菌T-RFLP分析过程中，PCR扩增体系的相关影响因素进行优化和筛选，建立适于湿地沉积物的简单、高效和稳定的PCR反应体系，为进一步开展沉积物细菌群落结构研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

沉积物于2012年8月采自松江湿地哈尔滨段，采集深度为0～20cm，将沉积物用无菌塑料袋密封带回实验室，-20℃冷藏。

PCR试剂所用试剂Taq酶、Mg2+、dNTPs和标准相对分子质量Marker（简写为M） DL2000均购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司，引物由上海生物工程有限责任公司合成。

1.2试验方法

DNA提取及检测：采用MOBIO土壤微生物DNA强力提取试剂盒对0.25g沉积物进行微生物总DNA提取，具体方法按照制造商的说明使用，所提取的DNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测其纯度。

PCR扩增程序与正交试验设计：采用细菌16S rRNA基因通用引物8F（5'-AGAGTTTGATC-CTTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3'）进行PCR扩增，正向引物8F用6-FAM（羧基荧光素）标记在5'的末端。

PCR扩增程序如下：95℃预变性5min， 95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，循环34次。最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为lxTAE，205V稳压电泳8min，在紫外光成像系统下照相并记录分析。

在进行单因子试验分析影响因素之后，为快速准确地确定PCR最优反应体系，采用L16（45）正交设计，对PCR 5个因素（模板DNA、Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物）在4个水平上进行试验，20μL扩增反应体系（见表1）。

2结果与分析

2.1单因子试验与分析

2.1.1模板DNA含量

模板DNA的浓度与纯度是PCR是否成功的关键因素之一，DNA含量过高，会结合Mg2+，降低Taq酶的活性，产生非特异性扩增；DNA含量过少，PCR产物少且不稳定甚至无扩增。由图1电泳结果可知，DNA含量在l0～40ng之间均可扩增出条带，DNA含量在10ng时条带弱且不清晰，增加到20～40ng时条带均亮，所以选择20～40ngDNA含量为最佳。

2.1.2Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的产量和特异性有显著的影响，还能与反应液中的dNTPs、模板DNA及引物相结合，影响引物与模板的结合效率、模板与PCR产物的解链温度和产物的特异性及引物二聚体的形成。Mg2+浓度过高会降低PCR反应的特异性，出现非特异性产物；浓度过低会抑制Taq酶活性，降低PCR扩增产量。由图2电泳结果可知，Mg2+浓度在2.5mmol/L时条带颜色浅；2.0mmol/L时条带较亮；当降低到1.5、1.0mmol/L时条带逐渐变浅且弥散。因此，Mg2+最佳浓度为2.0mmol/L。

2.1.3dNTPs浓度

dNTPs是PCR扩增反应的原料，其浓度过高时，会导致聚合酶错误的掺入，并引起碱基错配，降低PCR扩增的忠实性；浓度过低时，又会影响合成效率。由图3电泳结果可知，dNTPs在2.5mmol/L时条带模糊小清晰，在2.0～1.0mmol/L之间时，随浓度降低条带逐渐变亮，所以dNTPs浓度选在2.0mmol/L时效果为最佳。

2.1.4引物浓度

引物是PCR特异性反应的关键因素之一，PCR扩增产物的特异性取决于引物与模板DNA结合的程度。引物浓度偏低会减少与模板DNA的结合率，使扩增效果降低；引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，容易增加形成引物二聚体的机会。由图4电泳结果可知，当引物浓度在0.2-0.15μmol/L之间时条带均亮，尤以0.2μmol/L最佳，扩增效果较好，引物浓度降低到0.1μmol/L时条带浅且弥散严重。

2.1.5Taq酶浓度

Taq酶用量偏低会使合成的效率降低，导致扩增产物减少；用量过高不仪造成浪费，而且会导致非特异性片段产物的积累，不易形成良好的扩增效果。从图5电泳结果可知，Taq酶含量在2.0、1.5、1.0、0.5U时条带均亮且明显，但从扩增效果和经济性两方面考虑，Taq酶浓度在0.5U时为最佳选择。

2.2正交试验结果与分析

按表l设计的16个PCR反应组合进行正交试验，扩增结果如图6所示。根据电泳检测结果，将16个处理按扩增条带强弱、背景颜色深浅和条带弥散程度打分。条带清晰亮度大、背景颜色浅、无弥散与特异性条带的最佳效果为16分，相反最差为1分。1～16组合的分数依次是：1、2、8、9、1、l、10、1、2、14、16、15、4、6、13、13。

通过分数求出各列各水平的和，可求知各水平的平均值（见表2）。然后用各列最大平均值减最小平均值求出极差R，极差值越大表示该因素影响程度越大。由极差可知，PCR反应中各因素影响力大小依次为：Mg2+>DNA模板>Taq酶>dNTPs>引物，其中正交试验的最佳反应组合是11号：DNA模板30ng，Mg2+ 2.0mmol/L，dNTPs 0.2mmol/L，引物0.2μmol/L，Taq酶0.5U。

3讨论

松江湿地沉积物细菌结构的组成、分布、变化不仅是其自身生物特征的反映，也是其对周围环境因素的一种响应。由于近年来旅游资源的开发，人为干涉因素增多，松江湿地的环境因素变化较大，其沉积物中的微生物结构也会发生相应改变。T-RELP分析技术是建立在PCR基础之上研究微生物多样性的一种新兴分子生物学研究方法，不依赖于原始培养可较快地对微生物群落结构进行分析。利用T-RELP分析技术对松江湿地沉积物细菌结构进行分析，能更好地反映松江湿地生态系统的现状，而建立一个良好的PCR体系是后续研究的必要基础。

由于T-RELP是建立在PCR基础之上的分子技术，如果对其在DNA提取、PCR扩增等过程中的技术细节不注意，则有可能对T-RFLP分析结果产生误差。DNA提取是PCR扩增反应的前提，其纯度和质量是整个试验的基础和关键，由于试验样品的差异，会使每次提取的DNA纯度有所不同，从而影响PCR反应体系的建立。另外，由于基因组DNA相对分子质量较大，在DNA提取过程中会因动作剧烈、枪头空间小等原因使基因片段发生断裂，因此，为获得完整的DN段，在试验过程中应尽量避免剧烈震荡。

在PCR扩增程序中，模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶都会不同程度的影响反应结果。其中，Mg2+是Taq DNA聚合酶活性的激活剂，影响酶的活性与忠实性，Mg2+还能与模板和引物结合，从而影响引物与模板的结合效率及引物二聚体的形成。DNA模板含量是PCR扩增反应的关键因素之一，DNA量过高会导致非特异性片段的出现，模板量过低会降低反应效率。dNTPs、引物的质量和浓度与PCR扩增效率也有着密切关系，过低或过高都会影响扩增效率，甚至会阻止反应进行。

试验结果表明，不同的反应体系会对PCR扩增效果产生较大影响，合理的PCR反应条件是进行扩增与后续T-RELP分析的基础。因此，在PCR扩增反应试验过程中运用单因子试验与正交设计进行体系优化，结合正交试验图表结果分析各因素间的相关性，可快速准确地识别出反应中的关键影响因素。与单因素试验相比，正交试验能更标准、快速地找到目标最优化体系，且试验重复少、客观准确性高、代表性强，现已被广泛运用于PCR体系优化试验中。通过单因子试验与正交设计对PCR扩增反应中各因素的比较，确立沉积物细菌T-RFLP分析中PCR反应中最优体系为：DNA模板30ng，Mg2+ 2.0mmol/L， dNTPs 0.2mmol/L，引物0.2μmol/L，Taq酶0.5U。此反应体系重复性好、稳定性强，可较好地应用到后续的T-RELP分析中，为今后开展松江湿地沉积物微生物的相关研究奠定了良好基础。