真武汤中附子和芍药不同配伍对大鼠肾脏炎症的影响

摘要：目的 观察真武汤中附子、芍药不同配伍对大鼠肾脏炎症的干预作用，探讨“少火”、“壮火”的内涵。方法 实验选用60只大鼠，除空白组外其余各组均采用尾静脉注射单克隆抗体1-22-3造成大鼠肾小球肾炎模型，在此基础上按照不同干预方法随机分为空白组、模型组、缬沙坦组、高附低芍组、附芍等量组、低附高芍组。造模成功后持续灌胃给药，空白组与模型组给予等量生理盐水灌胃，干预2周后处死大鼠，分别观察其肾组织形态学改变，并检测血清炎症指标超敏C反应蛋白（hs-CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6 （IL-6）水平。结果 附芍等量组、低附高芍组及缬沙坦组皆可显著抑制大鼠肾小球系膜细胞增生及细胞外基质扩张，对hs-CRP、TNF-α、IL-6水平亦有不同程度抑制作用，其中附芍等量组效果优于低附高芍组，但仍逊于缬沙坦组，而高附低芍组反而加速疾病进展。结论 真武汤附芍不同配伍对肾脏炎症具有抗、促炎效应。

关键词：真武汤；附子；白芍；肾小球肾炎；少火；壮火；大鼠

温阳法为中医八法之一，在慢性肾脏病治疗中运用广泛[1]，近年来，随着火神派的发展，该疗法更加得到了中医界广大同仁的重视，临床研究发现合理运用温阳法对肾脏疾病疗效显著[2]，正所谓“少火生气”。然一些误区亦随之而来，认为火神派温阳即一味的壮阳，对顾护正气却重视不够，这显然是对火神派温阳理论的误解。早在《伤寒论》中即提出“火逆”的概念，是温阳太过而致疾病反复甚至加重的例子，温阳药物配伍比例、剂量、治疗时间不当等皆可导致机体正气损伤，此温阳太过而致的不良反应即为“壮火食气”的体现。笔者在前期临床研究基础上[3]，通过真武汤中附子、芍药不同配伍干预肾脏炎症的实验研究，初步对“少火”、“壮火”内涵进行揭示，现报道如下。

1 实验材料

1.1 药物

真武汤由附子、白芍、茯苓、白术、生姜组成，原药材由江阴天江制药有限公司提供颗粒剂，批号1112351。中药组将不同配伍比例的真武汤按照其各自用药浓度加入生理盐水配成药液，其中高附低芍组（附子25份，白芍5份，茯苓3份，白术3份，生姜1份）原药材浓度为925 mg/mL，附芍等量组（附子5份，白芍5份，茯苓3份，白术3份，生姜1份）原药材浓度为425 mg/mL，低附高芍组（附子1份，白芍5份，茯苓3份，白术3份，生姜1份）原药材浓度为325 mg/mL；缬沙坦胶囊（商品名代文，80 mg/粒，批号X1007，北京诺华制药有限公司），加生理盐水配成2.5 mg/mL药液。

1.2 试剂与仪器

单克隆抗体1-22-3由日本Niigata University （新泻大学）肾脏病研究所制备；超敏C反应蛋白（hs-CRP）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6试剂盒由北京晶美生物工程公司提供，按说明书操作，并进行质量控制。酶标仪（瑞士帝肯公司Rainbow型）由专人操作，自动打印结果。

1.3 动物

SPF级雌性SD大鼠60只，体质量190～210 g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2012-0021。2013年1-3月饲养于南京中医药大学实验动物中心，温度（22±2）℃，相对湿度55%±2%。实验期间大鼠于清洁环境中予标准饲料，自由进食、饮水。

2 实验方法

2.1 造模与分组

50只大鼠尾静脉注射单克隆抗体1-22-3，每只500 ?g，以尿蛋白结果判定模型是否成功[4]，按照不同干预方法随机分为模型组、缬沙坦组、高附低芍组、附芍等量组、低附高芍组。另外10只大鼠尾静脉注射相同体积生理盐水作为空白组。

2.2 干预方法

各治疗组分别给予相应药物，灌胃给药，每日2次，每次10 mL/kg。空白组及模型组给予等量生理盐水。连续2周。

2.3 观察指标

2.3.1 一般检测 给药结束后取每只大鼠的左肾，部分肾组织用10%中尔马林固定，石蜡包埋，切割制备2～3 ?m的组织薄片，进行PAS染色。采用半定量方法分析肾小球形态学损伤及系膜基质增生情况。

2.3.2 超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6测定 2周给药结束后，乙醚麻醉状态下解剖大鼠，经心脏采血5 mL，测定血清hs-CRP、TNF-α、IL-6。采血过程中避免溶血，待血块收缩后，4000 r/min离心10 min，取血清置-75 ℃冰箱保存，采用双抗夹心ELISA法测定血清中上述各指标浓度。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据均用—x±s表示，采用方差分析。P

4 结果

4.1 各组大鼠肾小球形态学损伤情况

光镜结果显示，空白组肾脏组织几乎无变化，模型组实验结束后可见广泛的系膜细胞增生，并伴有系膜基质扩张，大约10%肾小球可见新月体形成，附芍等量组、低附高芍组及缬沙坦组大鼠肾小球组织学损伤皆得到显著改善，其中附芍等量组效果优于低附高芍组，但仍逊于缬沙坦组，而高附低芍组系膜细胞及基质增生加重。

4.2 各组大鼠系膜基质指数比较

本研究对各组每张肾组织切片肾小球系膜基质扩张进行半定量分析，系膜基质指数（肾小球系膜基质区面积占肾小球面积百分比）附芍等量组、低附高芍组及缬沙坦组皆低于模型组，其中附芍等量组低于低附高芍组，但高于缬沙坦组，而高附低芍组高于模型组及其他治疗组。结果见图1。

4.3 真武汤附芍不同配伍对大鼠血清超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的影响

附芍等量组、低附高芍组及缬沙坦组大鼠血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平较模型组皆有不同程度降低，其中附芍等量组低于低附高芍组，但仍高于缬沙坦组，差异有统计学意义（P

5 讨论

慢性肾脏病（CKD）为绝大多数肾脏损伤相关性疾病的临床统称，近年来，该病的发病率有逐年上升的趋势，严重影响患者及其家属的身心健康，且大大加重了社会卫生医疗保健的负担[5]，中医中药治疗有很大优势，早期主要涉及益气补肾、活血通络、攻下导毒等治法，能很好地延缓患者病情的进展。针对该病后期阳虚水停的常见病理特点，治疗方面除上述治法外，温阳利水法亦有独到的作用。以仲景温阳利水代表方真武汤为例，该方在CKD的治疗中早已被人熟知[6]，作为温肾抗炎的名方，附子的作用功不可没，但应用附子时亦有一定的规则，在把握用量、用时的同时，亦要注意其配伍[7]，否则不仅影响抗炎效果，而且会适得其反。仲景在真武汤的配伍中注意运用芍药阴柔来制约附子的过度温燥，防止其火热太过而导致伤及正气，即是对火旺伤正、壮火食气的充分预见。适当的温阳可以调节肾脏功能，而温阳太过则易伤及机体正气，导致病情的反复甚至加重，如何适当把握温阳药物运用的“度”，目前临床尚存在争议，其所蕴含的相关现代医学机制尚有待进一步研究。

现代医学对CKD的认识众多，炎症作为其病理机制的中心环节[8]，已成为治疗的重要靶点。前期我们的对照研究发现，适当浓度及作用时间的温阳治疗，可以调节寒证患者机体免疫及抑制肾脏炎症反应[9-10]，而阳热太过则适得其反，会导致患者TNF-α、IL-6等炎症因子释放增加[3]，初步证实了“少火生气、壮火食气”与炎症免疫调节的关系。

课题组前期研究发现一次性静脉注射单克隆抗体1-22-3能够造成大量的、一过性的蛋白尿，与以往其他肾炎模型相比，该方法周期短，操作简便，且肾小球形态学损伤明显[2]。造模成功后在光镜下发现该大鼠模型肾组织中存在大量肾小球炎症细胞浸润，进而导致系膜细胞增生及系膜基质扩张。

在前期工作基础上，我们选用真武汤中经典的附子、白芍配伍作为本研究的载体，在仲景原方附芍配伍比例及用量的基础上，并参考前期与附子配伍相关的文献进行进一步摸索[11-12]，分别选用附芍5∶1、1∶1、1∶5的配伍比例模拟温阳法干预肾脏病炎症进程中的作用变化，以期更为全面探讨其作用机制。结果显示，附芍等量组、低附高芍组及缬沙坦组皆可显著抑制大鼠肾小球系膜细胞增生及细胞外基质扩张，对炎症指标hs-CRP、TNF-α、IL-6水平亦有不同程度抑制作用，其中附芍等量组效果优于低附高芍组，但仍逊于缬沙坦组；而高附低芍组反而加速疾病进展。这不仅说明了仲景原方附芍配伍合理性，更为我们在临床认识少火生气、壮火食气及合理运用温阳法提供了实验依据。

基于上述研究，我们初步找到了“CKD-炎症-真武汤（附芍不同配伍）-少火生气、壮火食气-抗炎、促炎”之间的逻辑关系，对“少火”、“壮火”理论内涵作出了较为深入揭示。

参考文献：

[1] 杨枫.《伤寒论》中附子的配伍及其运用[J].光明中医，2008，23（4）：414-416.

[2] 马俊杰，张静静，周春祥.药浴对慢性肾脏病Ⅲ期伴高脂血症患者血脂水平的影响[J].南方医科大学护理学报，2013，20（2A）：4-7.

[3] 马俊杰，周春祥.基于药浴治疗慢性肾脏病安全性相关机制研究探讨壮火食气的内涵[J].时珍国医国药，2013，24（6）：79-80.

[4] Kawachi H， Orikasa M， Matsui K， et al. Epitope-specific induction of mesangial lesions with proteinuria by mAb against mesangial cell surface antigen[J]. Clin Exp Immunol，1992，88（1）：399-404.

[5] El Meguid NA， Bello AK. Chronic kidney disease：the global challenge[J]. Lancet，2005，365：331-340.

[6] 宋伟，李明哲，关佳楠，等.真武汤对肾阳虚肾衰模型大鼠肾脏病理影响[J].中国中医基础医学杂志，2011，17（12）：1336-1337.

[7] 刘萍，黄川锋，李玲，等.附子配伍贝母对大鼠心、肝、肾脏毒性的实验研究[J].时珍国医国药，2010，21（7）：1801-1803.

[8] Csaba P Kovesdy， Kamyar Kalantar-Zadeh. Novel targets and new potential：developments in the treatment of inflammation in chronic kidney disease[J]. Expert Opin Investig Drugs，2008，17（4）：451-467.

[9] 马俊杰，周春祥.基于对80例慢性肾脏病患者炎症干预的研究探讨药浴疗法“洁净府”机制[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：591-593.

[10] 马俊杰，周春祥.基于对肾脏炎症干预的研究探讨药浴疗法“洁净府”机制[J].辽宁中医，2011，38（11）：2222-2224.

[11] 张广平，解素花，朱晓光，等.附子甘草配伍减毒增效/存效实验研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19（6）：31-34.

[12] 孙敬昌.附子白芍配伍的理论探讨及对心肌缺血动物作用的初步观察[J].山东中医药大学学报，2000，24（3）：209-214.