孢子型乳酸菌对常用抗生素耐药性及最低抑菌浓度测定

摘要：利用ＭＲＳ选择性培养基，从商业产品倍健素中分离出其主要成分孢子型乳酸菌。通过药敏纸片法测定其在体外对临床常用抗生素的敏感性及对饲料常用添加抗生素的ＭＩＣ值，以指导临床用药及饲料药物添加，同时进行质粒抽提研究。结果表明，该菌株对于多种临床常用抗生素较为敏感，致使这些抗生素与该产品不能同时使用，大大降低了临床抗生素的使用范围。但质粒抽提结果表明，该菌株不含有任何耐药性质粒，即该菌株用于益生保健产品的开发，具有分子生物学参考意义。

关键词：孢子型乳酸菌；药敏试验；ＭＩＣ值；质粒

中图分类号：Ｓ８５４．５＋２ 文献标识码：B 文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０12）03-0018-02

倍建素是由湖南普菲克生物科技有限公司开发的一种微生态制剂，其主要成分是孢子型乳酸菌（Ｂａｃｉｌｌuｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，８０亿ＣＦＵ／ｇ），是集乳酸菌和芽孢菌的双重优势的益生菌产品。研究表明，乳酸菌对于多数肠道菌如大肠杆菌、沙门氏菌等所引起的动物腹泻有较好的预防和保护作用［１，２］。目前临床上对于抗生素的使用还十分广泛［３］，为了防止临床所用抗生素对孢子型乳酸菌产生抑制作用，对该菌的耐药性进行分析，对临床抗生素的使用具有十分重要的指导意义。另一方面，随着分子生物学的不断深入，证实许多细菌携带有耐药性质粒［４］。而这些质粒在细菌与细菌之间通过接合转移的方式，传播到其他细菌中，导致受体菌产生耐药性［５］。因此，了解该细菌是否携带有耐药性质粒，对于预防耐药性的传播具有举足轻重的作用。本试验采用ＭＲＳ选择培养基从产品中分离出乳酸杆菌，采用药敏纸片法检测其对临床常用抗生素的耐药性，进而分析该菌携带质粒的情况，一方面指导临床用药，另一方面可以确定该菌用于益生保健产品中的合理性。

１ 材料与方法

１．１ 试验材料

１．１．１ 指示菌 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ＡＴＣＣ３５２１８），金黄色葡萄球菌（Ａｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ａｕｒｅａｓ；ＡＴＣＣ２９２１３），粪肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；ＡＴＣＣ２９２１２）。

１．１．２ 试验样品来源 倍健素（孢子型乳酸菌）购自湖南普菲克生物科技有限公司。

１．１．３ 药敏纸片 购自杭州天和微生物试剂有限公司。

１．１．４ 其他药品 由市场购买。

１．１．５ 培养基 乳酸菌分离培养用ＭＲＳ液体培养基及固体培养基。指示菌培养用营养琼脂、普通肉汤。

１．２ 试验方法

１．２．１ 乳酸菌的分离 将样品无菌取出１ｇ，用无菌水稀释后接种于ＭＲＳ液体培养基进行细菌富集培养２４ｈ。然后划线于ＭＲＳ固体培养基上，培养２４ｈ后挑取单个菌落进行纯化，以获得纯菌。

１．２．２ 药敏试验 根据美国临床实验室标准化委员会（ＮＣＣＬＳ）标准２００５版的规定，采用药敏纸片进行耐药性测定。用牙签无菌蘸取纯培养物菌液，均匀地涂布于整个平板表面，放置约１０～１５ｍｉｎ，待表面干燥后贴上药敏纸片，于３７℃培养２４ｈ后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

１．２．３ 饲料中常用抗生素ＭＩＣ值的测定 采用微量肉汤稀释法，连续倍比稀释，再每管加菌液０．１ｍＬ，第１至６孔药物浓度最终分别为２５６、１２８、６４、３２、１６、８μｇ／ｍＬ。其中，第７孔为不含药物的空白对照。将接种好的试管密封，置３７℃恒温箱中孵育１６～２０ｈ，观察结果。

１．２．４ 质粒提取 参照文献［６］进行操作。

２ 结果

２．１ 药敏试验结果

通过药敏纸片法对乙酰甲喹（痢菌净）、呋喃唑酮（痢特灵）、利巴韦林（病毒唑）、芬苯达唑、泰妙菌素、复方新诺明（磺胺类）、头孢哌酮、青霉素Ｇ、多粘菌素Ｂ、庆大霉素、环丙沙星、链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星等１４种抗生素进行耐药性测定，结果见表１。结果显示，孢子型乳酸菌对于头孢哌酮、复方新诺明、环丙沙星、氟苯尼考、恩诺沙星都是极敏感，而只有对利巴韦林、芬苯达唑、乙酰甲喹、泰妙菌素为不敏感，这显示在临床用药时，应注意在使用孢子型乳酸菌的同时，应避开头孢哌酮、复方新诺明、环丙沙星、氟苯尼考、恩诺沙星等极敏感药物，同时应避免同时使用庆大霉素、呋喃唑酮、链霉素等高敏感药物，以防止这些药物致使孢子型乳酸菌不能达到其预期的预防保护效果。为了确保该产品的效果，应尽量使用利巴韦林、芬苯达唑、乙酰甲喹、泰妙菌素等不敏感药物，在不与其他致病菌耐药情况相冲突的情况下亦可考虑使用多粘菌素Ｂ、青霉素Ｇ等中敏感药物。

２．２ ＭＩＣ值测定结果

通过肉汤稀释法，对饲料药物添加剂金霉素、硫酸粘杆菌素Ｅ（抗敌素）、吉他霉素、喹乙醇、喹烯酮、土霉素、盐霉素、新霉素、杆菌肽锌、那西肽、维吉尼霉素（速大肥）、黄霉素、恩拉霉素、地克珠利等１４种抗生素的ＭＩＣ值进行测定，结果见表２。由表2可见，该菌对喹乙醇十分敏感，在３２μｇ／ｍＬ的药物浓度下就不能生长，其次是土霉素（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ），金霉素（ＭＩＣ＝２５６μｇ／ｍＬ）。而孢子型乳酸菌对于其他药物皆不敏感，其ＭＩＣ值皆大于２５６μｇ／ｍＬ。

２．３ 质粒提取结果

在细菌纯化过程中，挑取１０株单个菌落进行增菌培养，然后进行质粒携带情况分析。分析结果表明，该细菌不存在质粒，即该细菌不携带耐药性质粒，没有传播耐药性的潜在可能性。因此该细菌用于益生保健产品具有分子生物学参考意义。

３ 讨论

本试验从商业产品倍健素中分离出其主要成分孢子型乳酸菌，通过药敏纸片法测得该菌对头孢哌酮等３５．７％的已检药物为极度敏感，对庆大霉素等２１．４％的已检药物为高度敏感，对于多粘菌素Ｂ等１４．３％的已检药物为中度敏感，对于利巴韦林等２８．６％的已检药物不敏感。指示临床在运用孢子型乳酸菌的同时运用抗生素药物防治其他细菌性疾病时，在不与其他致病菌耐药性相冲突的前提下，只有２８．６％的药物可用。若用其他本试验已测药品进行预防或冶疗时，或可以将倍健素产品中的主要成分孢子型乳酸菌杀死，而达不到应用微生态产品的预期保健目的。对于饲料药物添加剂的ＭＩＣ值测定结果表明，喹乙醇（ＭＩＣ＝３２μｇ／ｍＬ）、土霉素（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ）、金霉素（ＭＩＣ＝２５６μｇ／ｍＬ）等部分药物在较低浓度即可以抑制孢子型乳酸菌的生长繁殖，应加以注意。质粒提取试验表明，倍健素产品中的孢子型乳酸菌不携带任何质粒，亦即表明孢子型乳酸菌中不含有任何耐药性质粒。将孢子型乳酸菌应用于益生保健产品，没有耐药性质粒转接和传播的潜在可能，具有分子生物学参考意义。

乳酸菌为兼性厌氧菌，在其生长过程中可消耗肠道内游离的氧，同时可以定殖于肠道，从而发挥菌膜屏障和化学屏障的作用；同时又可以产生有利于消化的酶、酸，从而达到保护肠道的目的［７，８］。随着国内临床观念由“冶”向“防”的转变，像倍健素这样的产品将会越来越受到养殖业的青睐，具有广阔的发展前景。

参考文献：

［１］ 李亚杰，赵献军．益生菌对肠道黏膜的影响［Ｊ］．动物医学进展，２００６，２７（７）：３８－４１．

［２］ 赵玲艳，邓放明，杨细平，等．生物防腐剂―乳酸菌素［Ｊ］．中国食物与营养，２００５（２）：２７－２９．

［３］ 藏金灿．细菌耐药性机制与临床合理用药［Ｊ］．安徽农业科学，２００７，３５（５）：１３７７－１３７９．

［４］ 张 杰，王 辰．肺部感染细菌耐药现状［Ｊ］．中华医院感染学杂志，２００２，１２（１）：７９－８０．

［５］ ＬＥＣＬＥＲＣＱ Ｒ，ＤＥＲＬＯＴ Ｅ，ＤＵＶＡＬ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ ｉｎ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９８８，３１９（３）：１５７－１６１．

［６］ ＡＮＤＥＲＳＯＮ Ｄ Ｇ，ＭＣＫＡＹ Ｌ Ｌ． Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｌａｒｇｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｃ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，４６（３）：５４９－５５２．

［７］ 孟 涛．乳酸菌及其生长因子对人畜健康的作用［Ｊ］．生物工程进展，１９９３，１３（４）：４８－５２．

［８］ 黄 红，张伶俐，辛学琼．浅谈乳酸菌素的作用机理及应用［Ｊ］．职业卫生与病伤，２００４，３（１９）：２２９－２３０．