脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤及MMP-2、MMP-9表达的影响

摘要：目的观察脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织病理变化及MMP－2、MMP－9表达的影响，并探讨其可能的保护机制。方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，应用HE及S－P免疫组化法分别观察模型组及用药组大鼠全脑组织的病理改变及MMP－2、MMP－9表达的变化。结果假手术组大鼠脑组织形态结构正常，MMP－2、MMP－9见少量散在阳性表达或不表达；模型组大鼠大脑缺血再灌注区组织明显水肿、蜕变、坏死伴少量炎细胞浸润，对侧大脑相应区及双侧小脑轻度水肿，MMP－2、MMP－9表达较假手术组对应区显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，其中缺血侧大脑以坏死区边缘脑组织表达为甚，且较对侧大脑及双侧小脑明显升高(P＜0.05)；脑心通用药组大鼠大脑缺血区组织水肿、蜕变、坏死较模型组明显减轻，对侧大脑相应区及双侧小脑脑组织形态结构正常，MMP－2、MMP－9表达较模型组对应区显著降低(P＜0.05)。结论脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后包括病灶在内的全脑损伤有保护作用，其作用机制可能与降低MMP－2、MMI－9表达有关。

关键词：脑缺血；再灌注；脑心通胶囊；免疫组织化学；大鼠

中图分类号：R743.31 R285.6 文献标识码：A 文章编号：1672一1349(2007)04―0328―03

脑缺血再灌注后可出现脑水肿，加重因缺血、缺氧引起的神经细胞损伤，并导致颅内压增高、脑疝等并发症，是中风病人早期死亡的重要原因。再灌注损伤涉及到多方面的机制，近几年研究发现[1]，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)尤其是其中的明胶酶(MMP－2、MMP－9)表达的异常是脑缺血再灌注损伤的重要机制。临床实践表明脑心通在脑缺血再灌注损伤治疗中有较好的疗效，但其确切机制尚不明[2]。鉴于此，本研究旨在建立大鼠脑缺血2 h再灌注24 h模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后，通过观察缺血再灌注组及脑心通用药组大鼠脑组织的病理组织学改变及MMP－2、MMP－9表达的变化以探讨脑心通在脑缺血再灌注损伤中的可能作用及机制。

1　材料与方法

1.1 动物与分组 取健康成年Sprague Dawley雄性大鼠45只，体重250 g～300 g，购自安徽医科大学实验动物中心(皖医室动第0l号)。饲养环境：温度(23～25)℃，湿度60％～70％，自然光照，复合颗粒饲料，自由饮水。将大鼠随机分成3组：假手术组(5只)、模型组(20只)、脑心通组(20只)。

1.2 试剂兔抗鼠MMP－2单抗、免抗鼠MMP－9单抗、S－PKit及DAB显色试剂均购自北京中山生物技术有限公司(除S－P Kit为美国Zymed公司产品外，其余均系美国Santa－Cruz公司产品)。

1.3　动物模型制作参照Zcalonga等[3]法，以10％的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中切口，逐层分离暴露右侧颈总动脉，靠近心端结扎，远心端做切口置人2－0鱼线(头端加热呈直径约0.3 mm的圆球形)，插入约18 mm～20Hm(距颈总动脉分叉处)，鱼线。逐层缝合切口，鱼线残端留置切口外约5 mm。再灌注时，将鱼线拔出约10 mm。模型成功的标志是术后动物出现同侧Homers征及动物麻醉清醒后出现以左前肢为主的偏瘫。给药途径：脑心通治疗组给予脑心通药液灌胃(2 g/kg；给药容积0.5 mL/100 g，每天1次，连续5 d)，于第5天灌胃1 h后手术制备局灶脑缺血再灌注模型(同上述模型组)，假手术组与模型组给予等量的生理盐水。再灌注24 h后，断头取脑，大脑、小脑均行冠状切面取材，其中大脑在以视交叉为中心处冠状切面取材。假手术组大鼠不作缺血处理，也不予药物治疗，取材部位同上。

1.4　病理形态学　上述取材脑标本10％中性甲醛固定，石蜡包埋，5 um连续切片数张，其中1张行HE染色，其余作免疫组化检测之用。

1.5 S－P免疫组织化学法组织切片先行煮沸抗原修复，具体操作按说明书进行，一抗稀释度为MMP－2(1:150)、MMP－9(1:120)，最后苏木精复染。阳性对照为已知的MMP-2、MMP－9阳性切片；阴性对照为用PBS代替一抗。阳性信号为棕黄色。阳性计数：结合HE图像相应区，各组每只大鼠相应部位均选1张切片，高倍镜下取10个视野，数阳性细胞数及阳性血管数，然后取各组平均值。

1.6 统计学处理实验数据采用均数±标准差

表示，各组间比较采用γ2检验及t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2　结　果

2.1　病理组织学改变　5只假手术组大鼠无1例死亡，40只造模大鼠中除模型组死亡3例，用药组死亡2例外，其余均成功。HE染色后，假手术组大鼠大、小脑组织形态、结构正常。模型组大鼠右侧大脑缺血区神经元及胶质细胞明显减少，残存神经元固缩蜕变，间质高度水肿，少量炎细胞浸润，缺血边缘区脑组织明显水肿，见少量格子细胞。左侧大脑对应区及双侧小脑呈较轻的水肿改变。脑心通用药组大鼠右侧大脑缺血区神经元及胶质细胞蜕变、间质水肿及炎细胞浸润较模型组明显减轻，左侧大脑对应区及双侧小脑未见明显异常。

2.2　免疫组织化学结果(见表1) 在假手术组大鼠的双侧大小脑组织MMP－2、MMP－9见少量散在阳性表达或不表达，其中MMP－2阳性表达略高，阳性定位主要在血管内皮细胞及星形胶质细胞胞质、胞膜中。模型组大鼠双侧大小脑组织MMP－2、MMP－9表达较假手术组对应区域显著升高。其中缺血侧大脑又较对侧大脑及双侧小脑明显升高(P＜0.05)。阳性表达除定位于血管内皮细胞、星形胶质细胞胞质、胞膜外，也见于神经元、小胶质细胞及炎细胞。从组织水平分布上，缺血侧大脑组织以坏死蜕变区的边缘脑组织阳性表达为甚，对侧大脑则呈较均匀的散在阳性表达，双侧小脑中均以Ⅳ脑室附近白质的微小血管表达较明显，其次是小脑皮质神经元。脑心通组大鼠双侧大小脑组织MMP－2、MMP－9表达较模型组对应区域显著降低。

3　讨　论

现代神经科学认为[4]，神经细胞、胶质细胞微血管内皮细胞间的相互依存关系是组成和维持脑功能及结构的必要条件，血脑屏障参与血脑物质交换的调节，而神经元的直接生存微环境是神经元和胶质细胞间的细胞间液即细胞外基质(ECM)。脑组织中ECM是维持血脑屏障(BBB)结构完整性的重要组成部分，其中基底膜尤为重要，它由ECM分子如Ⅳ型胶原、层黏蛋白和纤维连接蛋白构成，为血管的完整性提供结构支持[5]。基质金属蛋白酶是一组含锌酶的基因家族，其家族中的明胶酶

即MMP－2(明胶酶A)和MMP－9(明胶酶B)有一个纤黏蛋白结合域，可降解ECM、破坏脑血管外基底膜主要成分(黏蛋白和纤黏蛋白)从而破坏血脑屏障、改变毛细血管通透性导致血管源性脑水肿甚至出血性转化。

本实验中，首先病理形态学检测结果显示假手术组脑组织结构正常；缺血再灌模型组大鼠缺血区脑组织明显水肿、退变坏死，说明造模成功。其次，MMP－2、MMP－9在假手术组不表达或仅少量阳性表达，与文献报道基本一致[6，7]。而模型组大鼠脑组织MMP－2、MMP－9表达均较假手术组对应区域显著升高，其中尤以缺血侧大脑为甚；此与Rosenberg等[8]用细胞培养及免疫组化检测的结果基本一致。这表明MMP－2、MMP－9在缺血再灌注损伤中发挥了重要作用，结合模型组大鼠脑组织较假手术组呈明显水肿改变及MMP－2、MMP－9本身生物学功能，提示MMP－2、MMP－9参与损伤的部分机制是通过降解ECM尤其血管基底膜、破坏血脑屏障、引起血管源性脑水肿。新近国外有文献[9]报道，在MCAO脑缺血再灌注损伤中检测到MMP－2、MMP－9明显升高的同时伴有Ⅳ型胶原、层剩蛋白等ECM含量的下降，这为上述推论提供了证据。

本研究显示，脑心通治疗组大鼠缺血再灌注后其组织学损伤较模型组明显减轻，这说明脑心通对大鼠缺血再灌注后脑损伤有保护作用。与此同时，相应的MMP－2、MMP－9表达也较模型组显著降低则进一步提示脑心通可能通过下调MMP－2 MMP－9表达这一机制来对抗缺血再灌注损伤而发挥其保护作用的。而要完全证实则有待于进一步检测血脑屏障中Ⅳ型胶原、层黏蛋白和纤维连接蛋白等ECM的变化。

近几年临床和动物实验的研究发现，脑梗死急性期，除病灶侧外，在远离病灶的部位也出现血流及代谢的改变，临床上则表现为各种不同类型的神经机能联系不能，其形成机制目前认为可能与血流动力学改变及神经传导通路的抑制有关，但具体确切机制尚不明。Lzumi等[10]采用MCAO模型动态观察大脑中动脉阻塞后3 h、6 h、9 h和24 h冠状位大脑MRI的信号，发现MRI异常信号的出现除分布在MCA供血区外，还涉及同侧大脑半球MCA供血区之外的海马、梨状叶以及对侧大脑半球，并提示远隔部位异常信号为水肿。这表明MCAO模型可用于研究神经机能联系不能且脑水肿可能是其病理变化之一。Heo等[11]曾对27例非人类灵长类动物MCA缺血再灌注后，缺血区及非缺血区基底核进行了冰冻组织切片和血浆标本MMP－2、MMP－9的检测，结果显示二者均有局部表达及血浆水平的升高。本实验结果显示模型组大鼠非缺血侧脑组织较假手术组有轻度水肿，且MMP－2、MMP－9表达显著高于假手术组，与上述Heo等[11]结果较一致，进一步提示MMP－2、MMP－9可能是通过引起脑水肿参与了局灶性脑梗死继发全脑损害的形成机制，继而临床上表现出神经机能联系不能。脑心通治疗组大鼠非缺血侧脑组织的组织学改变及MMP－2、MMP－9表达则与假手术组无差异，这表明脑心通可通过抑制远隔部位脑组织MMP－2、MMP－9过度表达减轻远隔部位脑水肿进而减轻神经机能联系不能。

脑心通通过抑制脑组织MMP－2、MMP－9的表达不仅可减轻病灶组织的脑缺血再灌注损伤而且可减轻远隔部位脑水肿，表明脑心通治疗作用之外尚存在全脑的保护作用。

参考文献：

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[10] lzumi Y，Haida M，Hata T，et al．Distribution of brain oedema inthe contralateral hemisphere after cerebral infarction：Repeated MRImeasurement in the rat[J]．J Clin Neurosci，2002．9(3)：289―293．

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作者简介：余锋，现工作于安徽医科大学附属省立医院(邮编：230001)：胡向阳、董六一，工作于安徽医科大学；王文静、李淮玉、任明山，工作于安徽医科大学附属省立医院。

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