含羞草的总黄酮提取技术

【中图分类号】TQ46 【文献标识码】 A【文章编号】1672-3873（2011）03-0312-01

【摘要】文章分析了提取纯化含羞草中总黄酮的最佳工艺条件。优化了含羞草中总黄酮的提取纯化方法，为含羞草资源的综合利用和产业化开发提供了参考。

【关键词】含羞草 总黄酮 提取 纯化

含羞草为豆科含羞草属植物含羞草Mimosa pudica的全草，又名知羞草、怕羞草、喝乎草、刺含羞草等。主要分布在我国华东、华南、西南等地的山坡丛林、湿地、路旁,具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛、凉血止血之功效，临床多用于急性肝炎、神经衰弱、失眠、肺结核咳血、血尿、结膜炎、跌打损伤、带状疱疹等症。含羞草中含有大量对人体有益的活性物质，包括黄酮类、酚类、生物活性多糖、氨基酸类、有机酸类和其它微量元素。

一、材料与试剂

含羞草采自海南三亚,由海南大学植物学教授黄世满鉴定为豆科含羞草属植物含羞草的全植株；所用试剂均为分析纯。

二、方法与结果

1、 标准曲线的绘制

准确称取干燥恒重的芦丁对照品12.8 mg，加60%乙醇（体积分数，下同）溶解并定容置100 ml的量瓶中，摇匀得质量浓度为0.128 g/L的对照品溶液。分别取上述芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml于6只10 ml量瓶中，用60%乙醇补充至5 ml，各加入0.3 ml 5%亚硝酸钠，摇匀，放置5 min后各加入10%硝酸铝0.3 ml，摇匀。

2 、不同溶剂提取所得提取物得率及总黄酮得率的比较

1）不同溶剂提取所得提取物的得率比较

称取粉碎并过60目筛后的含羞草原料4份，每份20 g，分别选用50%的乙醇、80%的乙醇、甲醇、70%的丙酮4种不同的溶剂进行索氏提取，溶剂用量均为200 ml，提取时间为5 h。分别将提取液浓缩至稠膏状移入烘箱中烘干至恒重。称重，计算得率。

2）不同溶剂提取所得总黄酮的得率比较

分别吸取一定量由不同溶剂提取所制得的含羞草提取液于10 ml量瓶中，添加60%乙醇溶液使体积约为5 ml，按照上述绘制芦丁标准曲线的方法，依次加入0.3 ml 5%亚硝酸钠、0.3 ml 10%硝酸铝、4 ml 1 mol/ml的氢氧化钠溶液，混匀，用60%乙醇稀释至刻度。静置20 min后用紫外可见分光光度计法测定不同溶剂提取所得提取液的吸光度，重复3次测定，并根据标准曲线换算出总黄酮的得率，计算平均含量及RSD。

3 、 超声提取工艺的优选

样品溶液的制备与测定分别精密称定干燥并过60目筛的含羞草粗粉9份，每份20.00 g，以80%乙醇为溶剂，按正交实验表中所选取的因素水平分别进行超声提取。分别吸取一定量含羞草超声提取液于10 ml 量瓶中，添加80 %乙醇溶液使体积约为5 ml，按照上述绘制芦丁标准曲线的方法，依次加入亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠溶液，混匀，用80%乙醇稀释至刻度。静置20 min后测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量。

4 、 分离纯化工艺优选大孔吸附树脂Diaion HP-20特别适合对黄酮苷类化合物的富集分离，因此本实验采用大孔吸附树脂Diaion HP-20对含羞草黄酮粗提物进行分离纯化。具体操作为：取药材1 kg，干燥后粉碎过60目筛，按照以上最佳工艺进行超声提取，得到的粗提物经真空薄膜浓缩至体积减半，加2％活性碳室温超声脱色2次，20 min/次。抽滤，除去滤渣后继续真空薄膜浓缩至无醇味，得提取物。用大孔吸附树脂Diaion HP-20进行湿法装柱（色谱柱：6 cm×80 cm，柱体积：450 ml），以水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、乙醇溶剂系统进行梯度洗脱，控制洗脱流速为5 ml/min。分别收集不同浓度的乙醇洗脱液。将各部分洗脱液进行真空薄膜浓缩、后转移至旋转蒸发仪中真空浓缩至干燥粉末，计算得率。同时按照上述的紫外法检测总黄酮的含量。

用中等浓度40％乙醇洗脱效果较好，总提取物得率达到43.48%，总黄酮含量可达到87.38％；从洗脱情况看，总黄酮主要集中在40％～60％乙醇洗脱部位，水洗脱部位经理化检测发现除含少量的黄酮外，还含有较多的多糖等大极性化合物，可将这部分弃去，而20％乙醇、80％乙醇及乙醇洗脱部位相比之下则含少量的黄酮类成分。因此，按照以上方法对含羞草总黄酮粗提物进行分离富集与纯化，收集各洗脱部位，将40％～60％乙醇洗脱部位合并，进行真空薄膜浓缩后即可得到总黄酮提取物，经紫外测定总黄酮的含量达到76％。

5 、最佳提取纯化工艺

由实验得到最佳提取纯化含羞草总黄酮的工艺：新鲜含羞草干燥后粉碎过60目筛室温超声提取提取液真空薄膜浓缩至体积减半浓缩液加2%活性炭室温超声波脱色2次抽滤除去滤渣脱色液继续真空薄膜浓缩至无醇味上大孔树脂Diaion HP-20柱用水及乙醇混合溶剂梯度洗脱分别收集洗脱液将40%～60%乙醇洗脱液合并减压浓缩至干干浸膏样品检测含量成品。

三、讨论

本实验选用芦丁作为对照品,因为芦丁是黄酮化合物中比较有代表性的一种，其B环的3，4-邻二酚羟基部位发生紫外吸收,可以通过测定芦丁对照品的吸收度,从而求算供试品中总黄酮的含量。这是总黄酮含量测定实验中比较经典的方法。

通过实验证明，提取含羞草中总黄酮的最佳工艺为用10倍量的80%乙醇为溶剂超声提取3次，10 min/次。

本实验采用大孔吸附树脂Diaion HP-20分离含羞草中的黄酮类成分，选择不同浓度的乙醇溶液进行洗脱，得出40%乙醇溶液洗脱效果较好，总分离物得率达到43.48%，总黄酮含量达到87.38%。另外水洗脱部位得率较高，含少量黄酮，还含有较多的大极性化合物。在用大孔吸附树脂分离含羞草总黄酮时，可先用水洗脱，除去大量的大极性化合物，减少影响，再用40%乙醇进行洗脱。

现代药理研究表明，黄酮类化合物在心血管系统、内分泌系统和抗肿瘤方面具有明显的药理作用。含羞草总黄酮的药理活性未见深入研究。本文利用大孔吸附树脂分离纯化含羞草总黄酮，为进一步研究含羞草总黄酮的药理活性,更好地开发利用含羞草资源奠定了基础。

参考文献：

1、黄河胜. 黄酮类化合物药理作用研究进展［J］. 中国中药杂志，2000,25(10):499.

2、全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1975:464.