移植肾内新生淋巴管检测的临床意义

作者：吴卫真　华　朱凌峰　王栋　叶永峰　谭建明 【摘要】

目的： 探讨移植肾微淋巴管检测在排斥反应的诊断和移植肾病理分型上的临床意义. 方法： 对77例肾移植患者的134份移植肾组织标本，用Podoplanin单抗二步法免疫组化标记移植肾内淋巴管，计算移植肾内淋巴管密度(LVD)，根据不同的病理诊断进行对比分析. 结果： 肾功能稳定的移植肾组织LVD平均值最低，为1.03±0.31，与其他各组的两两比较均有统计学差异(P<0.05). 慢性/硬化性移植肾肾病组LVD平均值最高，为18.35±4.79，与其他各组间的两两比较均有统计学差异(P<0.01). 急性细胞性排斥反应与C4d+急性排斥反应比较无统计学差异(P>0.05). 结论： 检测移植肾内淋巴管增生有助于移植肾排斥反应的临床诊断和预后判断，并指导抗排斥治疗. 移植肾淋巴管生成可能参与慢性排斥反应的发生和发展.

【关键词】 肾移植；淋巴管生成；移植物排斥

Clinical implication of monitoring lymphatic neoangiogenesis in renal transplants

【Abstract】 AIM: To investigate the clinical implication of monitoring lymphatic neoangiogenesis in rejection diagnosis and pathological typing. METHODS: To identify the lymphatic neoangiogenesis, 134 biopsy specimens from 77 patients were performed on with immunohistochemical staining for anti?podoplanin monoclonal antibody. The lymphatic vessel density (LVD) was calculated and then compared among different specimens according to clinical diagnosis and post?transplantation duration. RESULTS: The lowest mean LVD (1.03±0.31) was observed in the specimens from transplants with normal function, which differed significantly from other groups (P<0.05). Compared with other groups, significantly higher mean LVD (18.35±4.79) was recorded in the specimens from transplants with chronic rejection (P<0.01). No significant difference in mean LVD was observed between the specimens with acute cellular rejection and C4d positive acute rejection (P>0.05). CONCLUSION: Monitoring the lymphatic neoangiogenesis is helpful for the clinical diagnosis of rejection and the evaluation of renal transplant prognosis. The lymphatic neoangiogenesis in renal transplants may be involved in the occurrence and development of chronic rejection.

【Keywords】 kidney transplantation; lymphangiogenesis; grafl rejection

0引言

淋巴管生成(lymphangiogenesis）参与体内许多生理和病理过程,如胚胎发育、伤口愈合、组织和器官再生、肿瘤生长和转移等. 淋巴系统又是重要的免疫器官，它既是免疫细胞的运输通道又在调节免疫细胞组织浸润中起重要作用. 有关移植肾内淋巴管生成的研究较少，国内尚未见有类似研究报道. 本研究采用淋巴管上皮细胞特异标志物Podoplanin单抗染色移植肾组织的淋巴管，通过对移植肾内淋巴管密度（lymphaticvessel density, LVD）的比较分析，探讨移植肾内新生淋巴管检测的临床意义.

1材料和方法

1.1材料

134份移植肾组织库存石蜡块切片，其中肾穿刺活检标本115份，移植肾切除组织标本19份. 分别来自77例肾移植患者，男44例，女33例，年龄19～69岁, 中位年龄40岁. 患者常规术式行肾移植术，术后以环孢素A或他克莫司为主的免疫抑制方案抗排斥治疗，并定期随访. 所有病例移植肾均进行1～3次穿刺活检，有完整的临床资料和病理检测结果，并排除移植肾感染、肾一、二级动脉栓塞. 移植肾标本获取时间为移植术后1~123 mo. 病理诊断为Banff标准，即A组：正常肾组织，16份；B组：肾功能稳定的移植肾，45份；C组：急性细胞性排斥，23份；D组：C4d+急性排斥，16份；E组：慢性/硬化性移植肾肾病，34份；F组：移植肾药损害，16份.

1.2方法

1.2.1移植肾穿刺活检及病理学检查

常规B超引导下经皮移植肾穿刺取得肾组织样本，HE染色后，以Banff2003标准进行病理学诊断. 所有样本均以免疫组化法进行补体经典途径裂解片断C4d标记，显微镜下观察,若肾小管周围毛细血管有C4d 沉积即为C4d 阳性. 存档标本40 g/L中性甲醛固定，石蜡包埋保存. 部分标本取自切除的肾脏（移植肾12份、正常肾组织16份）.

1.2.2微淋巴管免疫组化染色ElivisionTM plus 免疫组化二步染色（检测试剂盒购于福州市迈新生物公司 产品编号kit?9903）. 石蜡切片脱蜡和水化后，PBS（pH 7.4）冲洗3次，柠檬酸盐抗原修复液高温高压修复抗原(120℃，高压锅，喷气2 min)，30 mL/L过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗冲洗3次后，先后加滴50 μL的鼠抗 podoplanin（1∶50稀释，Angiobio Co ，编号11?003），50 μL聚合物增强剂（试剂A）和50 μL酶标抗鼠聚合物（试剂B），PBS冲洗，每张切片加滴100 μL新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察3~10 min，阳性显色为棕色. 蒸馏水冲洗后，苏木素复染，PBS冲洗返蓝20 min，切片经梯度酒精脱水干燥(二甲苯透明)中性树胶封片.

1.2.3微淋巴管形态学观察及计算微淋巴管密度（LVD）

由内皮细胞形成的条状、隙状等孤立或簇状结构呈棕黄染色及有管腔者为podoplanin 阳性管腔，podoplanin 阳性的管腔视为微淋巴管. 微淋巴管计数在盲法下进行，每张切片由2名病理医师分别计数，计算微淋巴管密度（LVD）. 计数方法：先于低倍光镜(40倍和100倍)下确定3个微淋巴管着色最密集的区域(hotpot,热点) ,然后在200倍视野下计微淋巴管,取3个视野的均值作为LVD. 2名医师计数差10%以上者重新计数.

统计学处理： 所有数据应用SAS 9.0 软件分析处理计量资料的样本多组之间的两两比较采用秩和检验（Kruskal?Wallis法），P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1不同病理类型的LVD值

将podoplanin 阳性淋巴管计数所得出的LVD，按不同的Banff病理分类，16例正常肾组织LVD平均值最低（1.03±0.31），34例慢性/硬化性移植肾肾病组LVD平均值最高（18.35±4.79），急性细胞性排斥组和C4d+急排组分别为3.33±0.92和3.56±1.12.

2.2不同病理类型之间LVD平均值的比较

正常肾组织组除与功能稳定的移植肾组比较无统计学差异外，与其它组比较均有统计学差异(P<0.05). 慢性/硬化性移植肾肾病组LVD与其它各组间的比较均有统计学差异（P<0.01）. 急性排斥中细胞性与体液性之间比较无统计学差异（P>0.05)，移植肾药物中毒组与功能稳定的移植肾组之间比较无统计学差异(P>0.05).

3讨论

移植物作为排斥反应的靶器官一直是观察和分析排斥现象的重点. 大量的移植肾程序性穿刺活检发现，部分肾移植患者临床无排斥征象，外周免疫监测亦未提示免疫活跃，但移植肾内却存在低水平的排斥病理现象，而且长期存在局限性免疫细胞浸润，此类患者移植肾失功率明显高与其他患者［1-2］. 虽然移植肾内存在局灶性免疫细胞浸润的机理尚不能阐明，但它作为一种亚临床排斥的标志性病理特征已被大家所认可［3］. 移植肾不仅是排斥的效应器官，而且还是独立于宿主的新生免疫器官［4-6］. 我们在以前的研究实证了移植肾内存在淋巴管增生这一特殊病理现象，移植肾内不同的免疫病理状态有着不同的微淋巴管病理特点［7］.

从我们得出的数据上看，正常肾组织与肾功能稳定的移植肾之间的LVD值没有统计学差别，同样免疫抑制剂肾中毒损伤与肾功能稳定的移植肾之间无统计学差别. 而肾功能稳定的移植肾与发生排斥（无论是急性细胞性排斥、C4d+排斥和慢性排斥）的移植肾之间有统计学差别. Stuht等［8］，对162例肾移植患者的程序性肾活检的研究中发现，移植肾内淋巴管的增生与肾移植时间无关，而与排斥（急性细胞性排斥反应和慢性排斥反应）有关. 因此我们认为，移植肾内微淋巴管并不是随移植肾存活时间延长而自然增生的生理过程，而是一种与排斥反应存在密切关系的病理过程.

在不同的Banff分类对比中发现，慢性排斥反应中淋巴管表现增生尤为明显，我们推测，淋巴管增生在慢性排斥的发生及其病理改变进程中起重要作用. 有研究认为，移植肾内长期存在的巨噬细胞浸润可能调节淋巴管生成［9］. 另有报道［8-10］，移植物内的淋巴管系统参与免疫细胞的转运和调节，已证实为抗原递呈细胞（APC）提供出路，并转运免疫活性细胞. 我们推测这些可能是淋巴管生成与移植肾内持续免疫反应相互调节的机理之一. 在急性细胞性排斥组与C4d+排斥组（通常被认为是以体液免疫为主的排斥反应）之间不存在统计学差异，这是否是因为体液免疫应答在淋巴管生成的相互调节中作用较弱还不得而知.

【参考文献】

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［7］叶永峰，吴卫真，谭建明，等. 免疫组织化学染色法在微淋巴管研究中的应用［J］. 实用医学杂志,2007,23（1）:15-16.

［8］Stuht S, Gwinner W, Franz I, et al. Lymphatic neoangiogenesis in human renal allografts: results from sequential protocol biopsies［J］. Am J Transplant, 2007,7(2):377-384.

［9］Kerjaschki D, Regele HM, Moosberger I, et al. Lymphatic Neoangiogenesis in Human Kidney Transplants Is Associated with Immunologically Active Lymphocytic Infiltrates［J］. J Am Soc Nephrol, 2004,15:603-612.

［10］Kerjaschki D. Lymphatic neoangiogenesis in renal transplants: A driving force of chronic rejection? ［J］. J Nephrol, 2006,19:403-406.