清开灵对缺氧体外血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

摘要：目的 观察缺氧对体外血脑屏障（blood brain barrier,BBB）紧密连接蛋白ZO-1表达的影响以及清开灵的干预作用。方法 通过体外培养Balb/c小鼠脑微血管内皮细胞系形成BBB，采用缺氧缺糖24 h建立BBB缺血损伤模型，分别以荧光实时定量和Western blot的方法测定BBB紧密连接蛋白ZO-1的基因转录和蛋白表达水平，同时观察不同剂量清开灵对ZO-1表达的影响。结果 与正常组相比，缺氧缺糖24 h可使BBB表达ZO-1明显减少（P

关键词：清开灵；血脑屏障；缺氧；ZO-1

中图分类号：R743.3 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）07-0846-03

Effects of Qingkailing Injection on Expression of Tight Junction ZO-1 of Blood Brain Barrier in Vitro Insulted by Hypoxia

Zhu Haiyan，Ma Tao，Lou Lixia，et al

Beijing Key Laboratory of TCM Protection and Utilization，Beijing Normal University（Beijing 100875）

Abstract:Objective To observe the effects of hypoxia on expression of tight junction ZO-1 of blood brain barrier（BBB） in vitro and the role of Qingkailing injection.Methods The BBB in vitro was established by culturing mouse cerebral microvasculature endothelial cells of Balc.The model of ischemic injury was established by oxygen and sugar be deprived for 24 h.The gene transcription and protein expression level of ZO-1 were measured by fluorescence real-time quantitative and western blot respectively.Meanwhile，the expression of ZO-1 caused by different dose of Qingkailing injection was detected.Results compared with control group，the expression of ZO-1 in BBB was reduced significantly after oxygen and sugar be deprived for 24 h（P

Key words:Qingkailing injection；blood brain barrier；hypoxia；ZO-1

缺血性中风一直是临床上的治疗难题，血脑屏障（blood brain barrier,BBB）的破坏既是脑缺血损伤的结果，又是进一步导致脑损伤的关键环节［1］，而BBB通透性的改变与紧密连接（tight junction,TJ）的主要成分ZO-1分布及缺失密切相关［2］。清开灵对缺血性中风急性期患者有良好的治疗作用［3,4］。探讨脑缺血后BBB 上主要功能蛋白ZO-1的改变及清开灵对其表达的影响，对脑中风初期的治疗及预后具有重要意义，同时还有助于揭示清开灵抗脑缺血性损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 Balb/c小鼠脑微血管内皮细胞系细胞（中日友好医院娄晋宁教授惠赠），经抗Ⅷ因子抗体、抗CD31抗体及DiI-乙酰化低密度脂蛋白标记摄取检测，符合内皮细胞特性［5］。

1.2 主要药品及试剂 清开灵注射液（每支10 mL，批号:810906A，北京中医药大学）；内皮细胞生长因子（由中日友好医院临床研究所病理生理室提取）；SV总RNA纯化系统试剂盒、反转录系统试剂盒（promega公司）；Power Sybr Green PCR Master Mix（ABI公司）；PVDF膜（millipore公司）；RIPA裂解液（普利莱基因公司）；ECL发光液（碧云天公司）；蛋白质Marker（Fermentas 公司）；Cocktail蛋白酶抑制剂、PhosSTOP磷酸酶抑制剂（Roche 公司）； BCA蛋白定量测定试剂盒（塞驰公司）。

1.3 主要仪器 Mx3000p定量PCR仪（ZA29-Mx3000P，Stratagene公司）；倒置相差显微镜（Olympus IMT-2）；高速冷冻离心机（HC-3018R，科大创新）。低氧CO2培养箱（MiniGalaxy A，RS biotech公司）；CO2培养箱（MCO-20AIC，SANYO公司），可见光紫外分光光度计（Multispec1501，岛津公司）；Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）；BioRad Mini-4垂直电泳槽和转膜仪（Biorad公司）；Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）。

1.4 脑微血管内皮细胞培养 液氮中取出细胞冻存管，37 ℃水浴箱迅速融化，传至已用明胶包被的培养瓶中，放入适量内皮细胞培养基，37 ℃、5%CO2培养箱培养，1 d～2 d换液，3 d～4 d传代一次，用胰酶消化细胞；实验采用第24代细胞。

1.5 实验分组 将单细胞悬液接种于60 mm培养皿中，每皿5×105 mL个细胞，加培养基4 mL，置CO2培养箱中孵育，待细胞90%以上融合时随机分为5组。正常对照组，细胞培养液换成有糖Earle液，在CO2培养箱中正常24 h培养。模型组，采用缺氧缺糖模拟缺血。细胞培养液换成无糖Earle液，在培养条件为37 ℃，5%CO2，1%O2的低氧CO2培养箱中培养24 h。清开灵低、中、高剂量组，缺氧缺糖同时分别加入0.25%、0.50%、1.00% 清开灵培养24 h。尼莫地平组，缺氧缺糖同时加入100 μg/mL尼莫地平培养24 h。每组设6个复孔。

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1.6 荧光实时定量PCR反应

1.6.1 总RNA提取 采用SV总RNA纯化系统试剂盒提取总RNA，在紫外分光光度计中测OD260、OD280值，计算RNA浓度和含量。采用反转录系统试剂盒进行mRNA反转录反应。

1.6.2 引物合成 通过检索NCBI获得小鼠ZO-1 mRNA基因序列，引物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计并合成。ZO-1:Forward 5' -AGGACACCAAAGCATGTGAG-3',Reverse 5'- GGCATTCCTGCTGGTTACA-3'，扩增片段长度86 bp；内参β-actin:5'- AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG -3'，Reverse 5'- TGG CGT GAG GGA GAG CAT AG -3'，扩增片段长度185bp。

1.6.3 荧光实时定量PCR反应 反应体系及反应条件：总反应体系25 μL，2 mix 12.5 UL，无RNA酶水5.5 UL，cDNA 5 UL，上游引物1 UL（10 μmol/L），下游引物1 UL（10 μmol/L），反应条件：95 ℃ 10 min预变性；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环。反应结束计算机自动计算CT值。 扩增效率标准曲线、熔解曲线和扩增曲线：每个引物均把CDNA按倍比稀释5次。观察熔解曲线和扩增曲线。

1.7 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS17.0软件分析。组间比较用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 标准曲线、熔解曲线和扩增曲线 求得标准曲线，基因扩增效率（Eff）95.2%，相关系数（Rsq）＝0.999，可见引物的Eff在（100±10）%，Rsq>0.98，呈良好的线性关系，定量结果准确可靠。各组目的基因PCR产物的扩增曲线平滑，有明显的指数扩增期；熔解曲线为单特异峰，Tm值均>80℃，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物。

2.2 荧光实时定量ZO-1基因转录量 CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，根据2-CT法求出初始cDNA的相对量。模型组ZO-1基因转录量显著低于正常对照组（P

表1 各组ZO-1基因转录量（x±s）

2.3 ZO-1蛋白表达量 与正常对照相比，模型组 ZO-1表达量降低78.90%，表明缺氧损伤能显著抑制细胞ZO-1蛋白的表达（P

表2 ZO-1蛋白表达量（x±s）

3 讨 论

缺血性脑中风会首先损伤大脑的BBB，使其结构和功能发生改变，造成BBB的屏障功能下降，通透性增加［6］。Preston［7］等通过计算BBB对大分子示踪剂和水分子示踪剂通透性的转运常数发现，大鼠短暂性脑缺血再灌注后BBB通透性的增加主要是由TJ开放导致，而并非是胞饮转运增强，脑微血管内皮细胞的TJ闭锁小带长度随着再灌注时间延长逐渐减少。

脑微血管内皮细胞间的TJ是BBB 最主要的物质结构基础，它能够封闭内皮细胞顶部的细胞间隙，阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内，是BBB 发挥屏障功能的主要结构［8］。在TJ的构成及功能等方面发挥重要作用的胞质附着蛋白家族，尤其是ZO-1的缺失、分裂，与屏障渗透性的增加有着密切的关系［9］。ZO-1是第一个被证实的TJ胞质蛋白，是膜结合鸟苷酸激酶同系物家族中唯一可形成高度稳定二聚体的蛋白［10］。正常情况下，ZO-1在细胞膜表面表达，并且在胞质内有多个结合位点，能与跨膜蛋白和TJ蛋白的C端相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起。同时，ZO-1还与另一个胞质附着蛋白2扣带蛋白的尾端相连，为附着蛋白和跨膜蛋白的连接提供支架。因此，ZO-1对维持TJ的连续性和完整性发挥重要作用。

BBB的破坏既是脑缺血损伤的结果，又是进一步导致脑损伤的关键环节。在缺血早期，微血管内皮细胞上炎症因子的表达使缺血性损伤向炎性损伤转变，白细胞与微血管内皮细胞黏附后从血管内向脑实质转移，改变TJ的结构，导致ZO-1的崩解，进而诱发血管源性水肿和出血［11，12］。

清开灵可以抑制缺血损伤的脑微血管内皮细胞炎症调节因子NF-κB 的表达，下调黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达水平，减少白细胞的黏附 ［13，14］。本研究发现，缺血24 h后脑微血管内皮细胞中ZO-1的基因转录及蛋白表达均明显减少，而清开灵可明显增加ZO-1的基因转录和蛋白表达，并表现出剂量依赖的趋势。但是清开灵对ZO-1基因转录和蛋白表达水平的影响并不平行，对ZO-1转录后的调节表现出更强的干预作用，使蛋白表达显著升高，清开灵高剂量组ZO-1的表达量甚至超过了正常状态下BBB的表达，这说明损伤状态下的BBB对清开灵的反应非常敏感。清开灵能通过其他途径放大其对ZO-1蛋白表达的影响。

“毒损脑络”是清开灵治疗缺血性脑中风的理论基础。该理论认为中风发病是由于毒邪损伤脑络,络脉破损或络脉拘挛瘀闭,气血渗灌失常所致［15］。脑微血管在分布和功能等方面与中医络脉相似［16］，清开灵不但能够抑制缺血后白细胞活化对微血管内皮的毒性损伤，还能恢复脑微血管BBB的分子结构和功能，进而保证气血的正常运行。有关清开灵对TJ 的作用机制还需进一步的研究证实。

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作者简介:朱海燕（1974―），女，助理研究员，博士，现工作于北京师范大学资源保护与利用北京市重点实验室（邮编：100875）；马涛，工作于北京中医药大学东方医院实验中心；娄利霞、徐冰、高永红（通讯作者），工作于北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室（邮编：100700）；娄晋宁，工作于中日友好医院临床研究所；刘明岭，工作于山东中医药大学附属医院。

（收稿日期：2011-03-13）

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