桂西重楼总黄酮体外抗氧化活性研究

摘要：研究了桂西重楼总黄酮的体外抗氧化活性，旨在为抗氧化新药的开发提供理论依据。采用70%乙醇为提取溶剂，1∶40（g∶mL）的料液比，通过回流提取法对广西重楼总黄酮进行提取，经减压浓缩得总黄酮。结果表明，重楼对ABTS+・、DPPH・、・OH的清除能力以及对Fe3+的还原能力均较强，说明桂西重楼总黄酮的体外抗氧化活性较强。

关键词：桂西重楼；总黄酮；体外；抗氧化

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0538-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.03.037

Study on Antioxidant Activity in Vitro of Total Flavanone

from Polyphylla in Western Guangxi

MO Lu1a，HUANG Ya-zhen1a，ZHANG Hui1a，MA Xiao-ting1b，HUANG Jing-ying1c，HUANG Suo-yi1b，2，TAN Bing1b

（1.Youjiang Medical University for Nationalities，a. College of Clinical Medicine；b.College of Pharmacy；c. College of Basic Medicine，Baise 533000，Guangxi， China；2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of the Characteristics of Ethnic Medicine of the Youjiang Valley， Baise 533000， Guangxi，China）

Abstract： The antioxidant activity in vitro of total flavanone from Polyphylla in western Guangxi was studied to provide theoretical basis for the development of new antioxidant drug. Using 70% ethanol as extraction solvent，with material-liquid ratio of 1∶40（g∶mL）， the total flavonoid of Polyphylla in western Guangxi was extracted by reflux extraction method，and then was obtained by decompression concentrator. The results showed that，polyphylla had strong scavenging capacity on ABTS+・，DPPH・， ・OH and strong reducing power on Fe3+. The total flavanone of Polyphylla in western Guangxi had a strong antioxidant activity in vitro.

Key words： polyphylla in western Guangxi； total flavanone； in vitro； antioxidant activity

重楼为百合科植物云南重楼（Paris polyphylla Smith var. yunnanensisiFranch）或七叶一枝花[Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.） Hara]的干燥根茎。重楼味苦，微寒，有小毒。归肝经。清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊。用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐[1]。近现代试验表明，重楼具有较强的抗肿瘤活性，其对恶性淋巴癌、肺癌、鼻咽癌、脑肿瘤及消化系统肿瘤等有较好的治疗作用。抗肿瘤机制主要是阻滞肿瘤细胞增殖周期、影响癌基因和抑制癌基因的表达、影响细胞信号的传导等[2]，重楼主要含甾体皂苷、黄酮、多糖等活性成分[2，3]，其中，黄酮类化合物具有镇痛、抗肿瘤、抗炎、抗氧化，抗抑郁、抗衰老、调节免疫、抗心律失常及降血脂等作用[2-5]。可见，重楼的黄酮类药物成分在治疗肿瘤疾病方面发挥了值得肯定的作用。此外黄酮类化合物还对免疫低下、高血脂、抑郁症等疾病的治疗及防衰老、抗氧化方面挥发重要作用。然而目前对重楼的化学成分研究仍比较少，其药理活性研究方面的文献报道也不多，生物活性作用物质基础不够明确，导致其在功能食品和临床上的应用受到局限。目前，国内外对重楼抗氧化研究甚少[6-11]。重楼的抗氧化性只限于重楼总皂苷和多糖，而重楼黄酮的抗氧化性未见报道。因此，国内外缺乏重楼总黄酮的抗氧化性研究，限制了重楼的进一步开发利用等问题[12，13]，因此需要进一步研究来阐明重楼总黄酮体外抗氧化活性及其作用机理，为抗氧化新药的开发提供理论依据。

1 材料c方法

1.1 材料

重楼购于广西百色市人民市场药材店。

1.2 仪器

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ-C型玻璃仪器气流烘干器（巩义市英峪予华仪器厂）；FA1204B型电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；SHH-11-4型恒温水浴锅（上海百典仪器设备有限公司）；SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；752型紫外可见分光光度计（上海精科实业有限公司）；RE-3000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 试剂

芦丁（上海金穗生物科技有限公司，批号：20150305）；ABTS对照品（上海金穗生物科技有限公司，批号：C18H24N606S4）；DPPH对照品（日本东京化成工业株式会社，217-591-8）。无水乙醇、过氧化氢、盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸二氢钠、三氯乙酸等均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 提取重楼总黄酮 将粉碎后的重楼粉末20.0 g以料液比1∶40加入70%的乙醇，在温度70 ℃提取2 h，提取2次的条件下进行回流冷凝提取，过滤，合并滤液，减压浓缩至近干，用适量蒸馏水溶解，得重楼黄酮样品原液75.00 mL，待用。

1.4.2 制作芦丁标准曲线 精确称量芦丁对照品10.0 mg，于烧杯中用60%乙醇溶解，定容至100 mL的容量瓶，得100 mg/L的芦丁原液。准确量取芦丁原液0.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mL分别置于6个50 mL的容量瓶中，用60%的乙醇稀释至25 mL；各加1.40 mL的5% NaNO2溶液，摇匀，室温放置5 min；各加1.40 mL 10% Al（OH）3溶液，摇匀，静置6 min；再取5 mL 1 mol/L的NaOH溶液放入容量瓶中，最后用60%乙醇定容至50 mL，分别得到浓度为0.00、8.00、16.00、24.00、32.00、40.00 mg/L的芦丁对照品待测液。10 min后，以加入0.00 mg/L的芦丁待测液作为空白对照，于510 nm处平行3次，测量吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，浓度C（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。

1.4.3 重楼总黄酮含量的测定 精密吸取重楼黄酮样品原液2.50 mL于50 mL的容量瓶中，依次加入1.40 mL的5%NaNO2溶液、1.40 mL10%Al（OH）3溶液及5.00 mL 1 mol/L的NaOH溶液后用60%乙醇定容至50 mL。以60%乙醇代替重楼样品原液作为空白对照，于510 nm处平行3次，测量吸光度。

1.4.4 重楼总黄酮的体外抗氧化活性

1）对DPPH自由基的清除作用。参考文献[14]，稍有改进。准确称取DPPH对照品2.0 mg，以95%乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶中，得0.002% DPPH对照品溶液，避光保存。以无水乙醇依次将重楼总黄酮样品原液稀释成2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L的浓度梯度。取5只干净具塞比色管，将各浓度重楼总黄酮待测液0.50 mL与4.00 mL 0.002% DPPH对照液加入各管中作为待测组。另取5只具塞比色管，以95%乙醇代替0.002% DPPH溶液作为对照组，再以蒸馏水代替重楼总黄酮待测液作为空白组。将3组溶液置于恒温水浴锅中，温度28 ℃，提取时间30 min处理后，以0.50 mL蒸馏水和4.00 mL 95%乙醇调零，于517 nm处平行3次测定吸光度A，各取平均值后，计算对DPPH自由基的清除率。

清除率=[A空白-（A待测-A对照）]/A空白×100%

2）对ABTS自由基的清除能力。将7 mmol/L的ABTS与2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等体积混合，室温避光放置12 h，得ABTS备用液。用无水乙醇稀释，使其吸光度范围在2.000±0.100，得ABTS+・检测液。取11只比色管，分为待测组3.00 mL ABTS+・检测液与0.30 mL各浓度的重楼总黄酮待测液，以95%乙醇代替ABTS+・检测液的对照组，95%代替重楼总黄酮待测液的空白组，各组混匀后，室温静置6 min，以无水乙醇进行调零，迅速在波长为734 nm处平行测定3次吸光度，取平均值。根据以下公式进行计算。

清除率=[1-（A待测-A对照）/A空白]×100%

3）对・OH的清除能力。利用Fenton反应进行测定。取6只具塞比色管，其中5只为待测组按重楼总黄酮待测液各浓度梯度编号，依次向每只管中加入1.00 mL的9 mmol/L FeSO4，2.00 mL的9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，2.00 mL相应浓度重楼总黄酮待测液，及2.00 mL的8.8 mmol/L H2O2溶液。在室叵路胖1 h。以蒸馏水代替重楼总黄酮待测液作为空白组。以无水乙醇进行调零，在510 nm处平行3次测定吸光度，并取平均值，按以下公式计算重楼总黄酮待测液对・OH的清除率。

对・OH的清除率=[（A空白-A待测）/A空白]×100%

4）对Fe3+的还原能力。取6只具塞比色管，其中5只作为待测组备用液，分别向其加入2.00 mL各浓度重楼黄酮待测液，2.00 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6）及2.00 mL 1% K[Fe（CN）6]，混匀后于50 ℃的电热恒温水浴锅中放置20 min。取出后向各管加入2 mL的10% CCI3COOH，混匀后分别取出2.00 mL置于另外的5只具塞比色管，依次向此5只比色管中依次加入2.00 mL蒸馏水和0.50 mL的0.1% FeCI3，混匀，作为待测组份。以无水乙醇代替重楼总黄酮待测液作为调零组，在700 nm处平行3次测定吸光度（A）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

以吸光度（A）为纵坐标，浓度C（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程，结果如表1所示。经线性回归，得芦丁标准曲线方程为A=0.011 8C+0.004 3，回归系数为0.999 3。

2.2 总黄酮含量测定结果

重复3次取平均值，得A=0.596，代入线性回归方程A=0.011 8C+0.004 3，计算得重楼总黄酮样品原液的浓度50 mg/L，即重楼总黄酮含量为0.003 8 g，提取率为0.019%。

2.3 体外抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除作用 对DPPH自由基的清除作用见表2和图1。由图1可以看出，对DPPH自由基的清除能力随着重楼总黄酮待测液浓度的增加而增大，且在0.00～8.00 mg/L增长幅度大，超过8.00 mg/L时，逐渐趋于平衡，清除率可达96.46%，其自由基清除率接近50%的浓度低于3.00 mg/L，说明桂西重楼总黄酮对DPPH自由基的清除能力作用极强。

2.3.2 对ABTS自由基的清除能力 对ABTS自由基的清除结果见表3及图2。从图2可以看出，桂西重楼总黄酮待测液在浓度为0.00～2.00 mg/L时，对ABTS+・的清除能力较小，低于20.00%；随着浓度的增加，清除能力逐渐增强，在2.00～4.00 mg/L增幅最大；之后趋于平衡，最大时可达96.62%。当浓度在3.00 mg/L时，清除率约为50%，表明桂西重楼总黄酮对ABTS+・的清除能力很强。

2.3.3 对・OH的清除能力 对・OH的清除率结果见表4和图3。由图3可知，各浓度的桂西重楼总黄酮待测液对・OH均有清除能力，随着浓度的增加清除率增大，即二者存在一定的正相关，但增幅不大，在浓度为10.00 mg/L时趋于平衡，清除率达36.78%，表明桂西重楼总黄酮对・OH的清除能力较强。

2.3.4 对Fe3+的还原能力 对Fe3+的还原能力结果见图4。由图4可知，随着桂西重楼总黄酮待测液浓度的增加，其吸光度增大，且增幅均匀，在2.00～8.00 m/L时呈一定的线性关系，说明其对Fe3+的还原能力增加。

3 小结与讨论

现代研究表明[15-17]，由于氧化损伤的机制在疾病的发展中起着重要的作用，因此，中药的抗氧化作用是其达到治疗效果的重要因素。很多疾病包括肿瘤、心脑血管疾病、老年痴呆等都不同程度地与自由基损伤有关。而黄酮类化合物是自然界中抗氧化作用最强的一类天然化合物，由于它具有很强的抑制活性氧、清除自由基作用，同时毒副作用相对小于化学合成药，因此黄酮类化合物一直是人们致力于寻找新药的重要研究领域。桂西重楼总黄酮对DPPH・、ABTS・及・OH自由基均具有较强的清除能力，对Fe3+表现出较强的还原能力，并随着重楼浓度的增大而增强。当对DPPH自由基的清除率达50%时，重楼待测液浓度低于3.00 mg/L；当对ABTS自由基的清除率达50%时，其所需重楼浓度约为3.00 mg/L，说明重楼抗氧化活性极强。

中国重楼资源丰富，云南、四川、广西等是中国重楼主产区，大多数对重楼的研究均是以云南滇重楼为研究对象，而重楼是广西的道地药材和优势资源，具有巨大的医药应用开发价值，但是，目前并没有深度开发利用，如果能开发利用广西重楼中草药资源，大幅度提高其附加值，不仅可以优化资源利用，而且可以为广西和全国的经济发展作贡献，应用前景广阔。

本研究立足于广西重楼的优势资源，为筛选出高效的药物和食品抗氧化剂，以及重楼的质量控制和药理作用研究及其深入开发奠定基础。

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