银杏滴丸对快速老化鼠超氧化物歧化酶影响

银杏具有重要药用价值，已知其化学提取物多达160余种。主要有黄酮类、萜类、酚类、生物碱、聚异戊烯、奎宁酸、亚油酸、蟒草酸、抗坏血酸、α-已烯醛、白果醇、白果酮等。其中成药制品可以防治高血压、心脑血管等疾病，对延缓衰老具有特殊的功效〔1,2〕。本文研究银杏滴丸对快速老化鼠超氧化物歧化酶(SOD)基因和蛋白表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1?1 样品 银杏滴丸为黑褐色小颗粒(某制药股份有限公司)。

1?2 试剂 聚赖氨酸(美国Sigma公司)；山羊抗大鼠SOD多克隆抗体（美国SANTA CRUZ公司)；丙二醛(MDA）测定试剂盒、SOD活性测定试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(中国TBD生物技术发展中心)。RT-PCR反应试剂盒(美国Promega公司)。免疫组化二抗试剂盒二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1?3 仪器 DYY-38B型电泳槽(北京六一仪器厂)；日立20RP52D高速冷冻离心机；平推切片机(德国LEICA公司)；病理图象分析显微镜(日本Olympus公司)；恒温水浴震荡器(美国Lab Line公司)；GeneAmp?PCR System 9700 PCR反应仪；Image Master?VDS Pharmacia Biotech光密度分析仪。

1?4 动物与分组 采用6月龄快速老化鼠（SAM-P/8）。（天津市中医学院附属第一医院），3级(SPF)级实验动物房饲养。试验分快速老化鼠对照组和快速老化鼠干预组2组，每组10只，银杏滴丸人体推荐摄入量为0?60g／（60kg·bw）。根据预试验结果，选择受试剂量为0?05g/（kg·bw）即相当于人体摄入量的5倍。受试物用蒸馏水配制成溶液，对照组给予等量蒸馏水，经口灌胃2个月，灌胃量0?2ml／(10g·bw）。处理完成后迅速处死小鼠取肝组织测定以下指标。

1?5 SOD活性、MDA含量测定 将肝组织0?3g匀浆，3000r／min离心取上清测定。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化法，按照试剂盒说明书。

1?6 免疫组化方法 用链霉卵白素抗生素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)对肝脏标本石蜡切片进行免疫组化染色，检测SOD蛋白在肝组织的表达。一抗为山羊抗小鼠SOD多克隆抗体，浓度均为1∶200，生物素化兔抗山羊二抗，以磷酸盐缓冲液（PBS）为一抗作阴性对照。细胞浆着棕黄色判定为阳性细胞。

1?7 RT-PCR方法 取肝组织采用改进的异硫氰酸胍酚-氯仿RNA快速提取法提取总RNA。260和280nm处测定RNA吸光度（A）值，评估纯度并计算其浓度。SOD上游引物5′-CCACTGCAGGACCTCATT-3′，下游引物5′-CAAGCGGCTTCCAGCATT-3′，所扩增的小鼠Cu-Zn SOD特异性基因片断应为260bps。小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH)上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，所扩增的小鼠GAPDH特异性基因片断应为452bp。RT-PCR按下列顺序加样：无核酸酶水26?4μl；AMV／Tf15×反应缓冲液10μl；dNTPMix(10mmol／Leach dNTP)1μl；上游引物50pmol；下游引物50pmol；25mmol／L MgSO4 2μl：AMV反转录酶1μl；Tfl DNA聚合酶1μl；RNA样品2μl；终体积50μl。试验条件为：42℃60min，94℃3min：变性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃1min，循环30次，72℃4min，4℃反应完成后，产物于-20℃保存；RT-PCR产物电泳检测、吸光度扫描分析。

1?8 统计分析 采用SPSS 11?0软件进行方差分析，对方差不齐的数据，适当变量转换后进行统计，变量转换后仍未达到方差齐，用非参数检验进行分析。

2 结果

2?1 银杏滴丸对小鼠MDA、SOD的影响(表1） 经口给予银杏滴丸后，快速老化鼠干预组肝匀浆中MDA含量低于其对照组，且差异有统计学意义(P<0?05)，SOD活性高于对照组，且差异有统计学意义(P<0?05)。

表1 银杏滴丸对快速老化鼠肝MDA、SOD的影响（略）

注：与对照组比较,*P<0?05

2?2 银杏滴丸干预后快速老化鼠SOD基因表达与其对照小鼠比较(图1) 由图1可见，给予银杏滴丸干预后，快速老化鼠SOD mRNA的RT-PCR产物电泳条带亮度明显增强，表明银杏滴丸可以引起快速老化鼠SOD基因表达增加。

M:Markers；1:SAMP／8干预组SOD；2:SAM-P／8干预组GAPDH；3:SAM-P／8对照组SOD;4:SAMP／8对照组GAPDH

图1 快速老化鼠银杏干预组和快速老化鼠对照组SOD基因表达电泳图（略）

2?3 免疫组织化学检测银杏滴丸干预后快速老化鼠SOD蛋白表达结果(图2) 由图2可见，SOD蛋白定位于肝细胞胞浆内，给予银杏滴丸干预后，快速老化鼠SOD蛋白表达明显增强，表明银杏滴丸可以使快速老化鼠SOD蛋白表达增加。3 讨 论衰老与O·-2、·OH及H2O2等活性氧密切相关〔3，4〕。银杏滴丸是由天然植物银杏叶提取而成，其主要成分为黄酮类及银杏内脂等。本研究结果显示，经口给予银杏滴丸后，干预组动物肝匀浆中MDA明显低于对照组、SOD活性明显高于对照组，表明银杏滴丸具有抗氧化作用〔5〕。与YoshikawaT等研究银杏提取物具有保护细胞膜结构和功能的完整性，抑制缺血时自由基产生，对抗细胞膜脂质过氧化所引起的病理过程和衰老过程的结果一致〔6〕。快速老化鼠给予银杏滴丸干预后，其SOD活性也明显增加。免疫组化结果显示，SOD蛋白在肝细胞浆内表达较对照组明显增加，和SOD基因表达上调相一致，提示银杏滴丸通过可能某种途径调控SOD基因的表达，使SODmRNA表达增加，进而SOD蛋白翻译量增加，表现为SOD活性较对照明显升高，使与衰老密切相关的活性氧自由基减少，从而发挥抗氧化作用和延缓衰老功能。银杏滴丸影响SOD基因表达的机制还有待进一步研究。此外，本研究采用快速老化鼠（SAM)是一近交系小鼠群，其特征为出现快速老化征候，高龄期频繁出现在人类老年常见的与老化相关的病态〔7〕，其寿命仅为正常小鼠的1／2左右。YokozawaT等对SAM鼠研究中也发现，其衰老过程中出现抗氧化能力下降，脂质过氧化产物的蓄积〔8〕。本试验选取了SAM P／8系小鼠，研究银杏滴丸对其抗氧化作用的重要酶类SOD基因、蛋白水平的表达和其活性的影响获得满意结果，并节省了人力物力。因此，快速老化鼠可以作为抗氧化保健品功能学评价，是开发延缓衰老食品、药物、保健品抗衰老研究的良好动物模型。

A：快速老化鼠组;B：快速老化鼠干预组

图2 快速老化鼠SOD蛋白在肝组织的表达(DAB显色，×400)（略）

【参考文献】

〔1〕 赵成林，吕建峰.银杏外种皮中酚酸性成分的抗真菌作用［J］.江苏药学与临床研究，2004，12(1)：32-33.

〔2〕 唐于平，楼凤昌，王欢，等.银杏外种皮的化学成分和药理作用［J］.药学进展，2000，24(3)：152.

〔3〕 Larsen PL，Albert PS，Riddle DL.Genes that regulate both development and longevity in caenorhabditis elegans［J］.Genetics，1995，139：1567-1583.

〔4〕 黄凤玲.人的衰老与自由基［J］.湘潭师范学院学报，1996，17(6)：62-66.

〔5〕 中华人民共和国卫生部.保健食品功能学评价程序和检验方法［M］.北京：卫生部卫生法制与监督司,2003:43-57.

〔6〕 Yoshikawa T,Naito Y,Kondo M.Ginkgo biloba leaf extract:Review of biological actions and clinical applications［J］.Antioxid Redox Signal,1999,1(4):469-480.

〔7〕 Takeda T.Senescence-accelerated mouse (SAM):a biogerontological resource in aging research［J］.Neurobiol Aging,1999,20(2):105-110.

〔8〕 Yokozawa T,Satoh A,Cho EJ.Ginsenoside-Rd attenuates oxidative damage related to aging in senescence-accelerated mice［J］.J Pharm Pharmacol，2004,56(1):107-113